治疗神经变性疾病的新手段和方法与流程

　　

　　本发明涉及治疗各种神经变性疾病、障碍和病症(特别是特征在于先天免疫激活或伴随先天免疫激活的那些疾病、障碍或病症)的化合物、组合物和方法，先天免疫激活可以通过将β-淀粉样肽(aβ)组装为更大的团聚体和斑块(plaque)而被触发。特别是，本发明人发现了，含有card的凋亡相关的斑点(speck)样蛋白(asc)的炎性体-依赖性招募和团聚在aβ-相关病理学中扮演重要作用。

　　基因和实验证据支持神经变性障碍中免疫激活的致病作用1。在阿尔兹海默症(ad)中，基因2,3和外遗传4研究、人ad脑的转录组分析5以及单核细胞中的表达定量性状实验6全部支持先天免疫机制的贡献作用。然而，ad-相关免疫激活与ad的经典标志之间的联系是不太明确的。将β-淀粉样肽(aβ)组装为病理种子以及它们随后的团聚代表ad的关键病理学之一。aβ对ad表现形式的关键作用得到了导致ad家族形式(fad)中增加的aβ产生和沉积的突变的支持7。在散发ad(sad)中，aβ可以发挥启动作用并且与病理过程的复杂网络相关联，这可能会随着时间的流逝而收敛，直到神经变性普遍存在并出现临床症状8。然而，尚未完全了解aβ团聚和病理学扩散的确切机制9。

　　重要的是，aβ病理学的沉积和扩散可能在临床症状出现之前数十年10，并因此这些过程中涉及的机制被认为保持对ad的治疗潜力。一旦团聚，aβ通过小胶质细胞模式识别受体感测，其导致病理性先天免疫激活和随后产生炎症介质11。最近已经记载了在ad患者和app/ps1转基因小鼠的脑中包含nacht、lrr和pyd结构域的蛋白3(nlrp3)炎性体(危险信号的中央传感器)的激活12。nlrp3或胱天蛋白酶-1的基因缺陷均能保护老年app/ps1小鼠免于小胶质细胞il-1β产生、aβ相关病理学和认知减退发展12。先前的发现证明了在类似的小鼠ad模型中il-1β阳性小胶质细胞的非常早期和局灶性免疫激活，引发了一个问题，即nlrp3炎性体的激活是否有助于aβ病理学的进展和扩散。激活后，nlrp3通过热蛋白(pyd)结构域相互作用招募含有card的接合体蛋白凋亡相关的斑点样蛋白(asc)，其触发asc螺旋状原纤维组装13。asc原纤维然后通过card相互作用招募效应胱天蛋白酶-1，导致自动蛋白水解激活，然后将asc原纤维组装为大的核旁asc‘斑点’14。事实上，朊病毒样聚合是先天免疫性和炎症的保守信号传导机制15。确实，除了引起促炎性il-1β细胞因子激活和释放外，nlrp3炎性体激活还导致组装的asc斑点的释放，这些斑点一旦释放到细胞间空间中，即可被邻近的髓样细胞吸收以维持持续的免疫应答16,17。asc表达在app/ps1动物中随年龄增加，但在野生型小鼠中并非如此。

　　阿尔兹海默症(ad)是工业化社会中衰老的最常见的神经变性障碍和第四大死亡原因，仅次于心脏病、中风和癌症，ad影响超过65岁的人群的5-11％，以及超过85岁的人群的30％。然而，与许多其他神经变性疾病一样，阿尔兹海默症仍然是不可治愈的，并且可用的治疗选择只是姑息治疗。迫切需要新的疗法和诊断方法以能够早期检测和治疗这些疾病。

　　基于上述内容，本发明的目标是克服当前治疗和诊断选项的缺陷并提供治疗、预防和检测神经变性疾病如ad的新手段和方法。

　　借助下面的和所附权利要求中陈述的主题实现该目的。

　　尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所使用的术语并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

　　在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方式一起列出，但是，应该理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建额外的实施方式。各种描述的示例和优选实施方式不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方式。该描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方式与任何数量的所公开和/或优选要素相结合的实施方式。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的说明书中公开了本申请中所有描述的要素的任何排列和组合。

　　在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则术语“包括”以及诸如“包含”和“含有”之类的变体将被理解为暗示包括陈述的成员、整数或步骤，但并不排除任何其他未陈述的成员、整数或步骤。术语“由……组成”是术语“包括”的特定实施方式，其中排除了任何其他未陈述的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包括”涵盖术语“由……组成”。因此，术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，如，“包括”x的组合物可以仅由x组成或可以包括一些另外的例如x+y。

　　在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一种”和“一个”以及“该”和类似提及应被解释为涵盖单数和复数二者，除非本文另有指示，或与上下文明显矛盾。本文中数值范围的叙述仅意图用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独的值都被并入说明书中，如同它在本文中被单独叙述一样。说明书中的任何语言都不应解释为表示对实践本发明必不可少的任何未要求保护的要素。

　　词语“基本上”不排除“完全”，如，“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。必要时，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。

　　相对于数值x的术语“约”意思是x±10％。

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　　详细描述

　　脑区域内和之间的病理学扩散代表神经变性疾病的标志。本发明部分基于如下发现：含有card的凋亡-相关斑点样蛋白(asc)“斑点”的炎性体驱动形成有助于阿尔兹海默症(ad)和其他神经变性疾病中的β-淀粉样(aβ)病理学。本发明人发现，通过小胶质细胞释放的asc斑点快速结合aβ并增加aβ寡聚物和团聚体形成，这起到aβ病理学的炎性驱动交叉播种(cross-seed)的作用。海马内(intrahippocampal)asc斑点注射导致app/ps1小鼠中aβ病理学的扩散。相反，app/ps1脑组织匀浆没有诱导asc缺乏型app/ps1小鼠中aβ-病理学的播种(seeding)和扩散。令人惊讶地，本发明人发现，共同施加asc配体阻断扩大的aβ病理学。这些发现说明，炎性体激活与神经变性疾病诸如阿尔茨海默症中aβ病理学的播种和扩散相联系，并支持能够阻断asc团聚的asc配体作为治疗和预防此类疾病的可行选项。

　　淀粉样-β团聚体的沉积和扩散是阿尔茨海默症的关键特性并且也被认为参与其他神经变性疾病。一旦团聚，淀粉样-β被小胶质细胞模式识别受体感测，导致病理学免疫激活和nlrp3炎性体的激活。nlrp3炎性体(作为危险信号的中央传感器的多蛋白复合物)招募acs并最终触发其组装为更大团聚体(“斑点”)，其被释放到细胞内空间。本发明人发现，释放的asc团聚体(“斑点”)快速结合淀粉样-β并增加淀粉样-β寡聚物和团聚体的形成，从而起到淀粉样-β病理学的炎性驱动交叉播种的作用，最终导致神经变性。

　　根据本发明的asc配体优选地起到asc的抑制剂的作用，并减少或消除其组装为更大团聚体(“斑点”)的能力。预防或减少这类asc“斑点”的形成的asc配体优选能够预防或减少淀粉样-β寡聚物、团聚体和斑块的形成。本发明asc配体因此设想可用于预防或治疗神经变性疾病，其优选地以asc团聚体(“斑点”)和/或淀粉样-β病理学的形成(特别是淀粉样-β团聚体的形成和扩散)为特征或与其相关。

　　在第一方面，本发明特征为含有card的凋亡相关斑点样蛋白(asc)的配体，其用于治疗或预防神经变性疾病的方法中。

　　如本文所使用，术语“配体”指的是能够与含有card的凋亡相关斑点样蛋白(asc)相互作用，优选结合的(大-)分子。优选地，配体与asc特异性相互作用或结。“特异性”相互作用或结合意思是相比其他非靶蛋白，配体更容易与asc相互作用或结合。在另一个实施方式中，配体不与在涉及asc的级联的上游或下游起作用的蛋白质相互作用。具体地，“配体”可能不与ph-激活的蛋白酶，例如为nlrp3炎性体下游的ph-激活的蛋白酶相互作用。优选地，“配体”不是β-淀粉样。更优选地，抗asc-斑点抗体特异性预防或减少aβ的asc斑点诱导的团聚。

　　配体优选能够调谐其靶标的生物学功能或生活活性。术语“生物学功能”(或“生物活性”)在本文用于指在生物(比如，但不限于在其自然或天然)环境中通过所述靶标介导的期望或正常作用。如果配体完全或部分预防、减少、抑制、干扰、阻断、增强、激活、刺激、增加、加强或支持所述生物学功能，则配体“调谐”其靶标介导的生物学功能。

　　配体可以直接或间接与其靶标相互作用。因此，本发明的asc配体可以与asc直接或间接相互作用，优选结合。本发明的asc配体优选通过(特异性)结合asc而与asc直接相互作用。然而，还设想了asc配体可以间接地与asc相互作用，如通过作用于影响asc生物学功能或活性的其他细胞或细胞间结构、成分或分子。“配体”可以例如通过与asc相互作用靶向asc，从而阻断asc与其他蛋白质例如nlrp3的相互作用。

　　术语“asc”是指通过pycard基因或其等位基因变体或直向同源物编码的含有card的人凋亡凋亡-相关的斑点样蛋白(uniprotacc.no.q9ulz3，进入版本2017年11月2日的#172，序列版本#2)。其也可以被称为“card5”或“tms1”。

　　“asc”优选地包含对应于根据seqidno:1的氨基酸序列的氨基酸序列或由其组成。下面描绘了通常被称为“规范”asc序列的该序列：

　　seqidno:1

　　热蛋白结构域(pyd)(上述序列中加下划线)位于范围从氨基酸1–91(seqidno:2)的氨基酸一段序列中。其被认为介导与蛋白(诸如nlrp3、pydc1、pydc2和aim2)的热蛋白结构域的同型相互作用。card结构域(上述序列中加粗)位于范围从氨基酸107–195(seqidno:3)的氨基酸一段序列中。其被认为介导与casp1和nlrc4的相互作用。

　　术语“asc”优选地还包括以根据seqidno:1的氨基酸为特征的asc蛋白的同源物、同工型、变体和片段。这些asc同源物、同工型、变体和片段优选包含与根据seqidno:1的“规范”asc氨基酸序列相比，展现至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的，优选地至少70％，更优选地至少80％，甚至更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％和最优选地至少95％或甚至97％的序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。

　　这些asc同源物、同工型、变体和片段优选是功能性的，即，保留以上面描绘的“规范”asc氨基酸序列为特征的asc蛋白的生物学功能或活性。因此，这类asc同源物、同工型、变体和片段可以通常至少保留负责所述生物学功能或活性的pyd和/或card结构域的最少部分。

　　asc是展示若干生物学功能或活性的衔接蛋白。在本发明的上下文中，以下功能和活性拥有特定兴趣(通常按从(1)-(5)的顺序出现)：(1)被nlrp3炎性体招募的能力，通常通过热蛋白(pyd)结构域相互作用，(2)在nlrp3招募后螺旋状原纤维组装，(3)效应胱天蛋白酶-1的招募，通常经由card相互作用，(4)自动蛋白水解激活和随后的组装asc原纤维为大的副核asc团聚体(“斑点”)和(5)诱导淀粉样-β寡聚和团聚。

　　功能性asc同源物、同工型、变体和片段优选展现至少相同的生物学功能和活性(1)-(5)。

　　术语“淀粉样-β”(或“aβ”、“β-淀粉样”、淀粉样β蛋白)指从app加工的39-43个氨基酸残基的一组肽中的任一个。术语“app”指通过app基因或其同源物、同工型、变体或片段编码的淀粉样-βa4蛋白(uniprotrefno.p05067,进入版本2017年11月22日的#266)。app是糖基化的单跨膜蛋白，其在许多哺乳动物组织的多种细胞中表达。目前已知存在于人中的app变体的实例是kanget.al.(1987)nature325:733-736描述的695氨基酸多肽(app695)：ponteetal.(1988)nature331:525-527(1988)和tanzietal.(1988)nature331:528-530(seqidno:56-57)描述的751氨基酸多肽(app751)；和kitaguchiet.al.(1988)nature331:530-532(seqidnos:54-55)描述的770-氨基酸多肽(app770)。按照惯例，即使提及较短的app蛋白的密码子位置，也可以使用最长app蛋白app770的密码子编号。通过分泌酶切割处理app以产生可溶性app或淀粉样-β肽。

　　术语“淀粉样-β”因此指源于app的β分泌酶切割的任何肽。这包括39、40、41、42和43氨基酸的肽，其从β-分泌酶切割位点延伸至β-分泌酶切割位点c-末端的39、40、41、42和43氨基酸。

　　特别地设想了根据本发明的asc配体用于治疗人的神经变性疾病。因此，asc配体优选能够(特异性地)与人asc或其同工型、变体和片段相互作用，更优选与之结合。然而，还设想将本发明的asc配体用于治疗非人动物。因此，本发明的asc配体还可以结合在非人动物中发现的asc同源物。

　　asc“同源物”包括“直向同源物”和“种内同源物(paralog)”二者。asc直向同源物包括由不同物种的基因编码的asc蛋白，这些物种是通过物种形成(直向同源物)从共同的祖先基因进化而来的。直向同源物在进化过程中通常保留相同的功能(一种或多种)。因此，当比较一对直向同源物时，功能可能会丢失或获得。asc种内同源物包括由基因组内基因复制产生的基因编码的asc蛋白。种内同源物通常会进化出新功能，或者最终可能成为假基因。

　　示例性asc“同源物”包括大猩猩(西部低地大猩猩)、白颊长臂猿(nomascusleucogenys)(北方白颊长臂猿)(白颊长臂猿(hylobatesleucogenys))、普通猕猴(macacamulatta)(恒河猕猴(rhesusmacaque))、阿努比斯狒狒(papioanubis)(东非狒狒(olivebaboon))、白枕白眉猴(cercocebusatys)(乌黑白眉猴(sootymangabey))(煤黑白眉猴(cercocebustorquatusatys))、豚尾猴(macacanemestrina)(猪尾猕猴(pig-tailedmacaque))、大黑猩猩(pantroglodytes)(黑猩猩)、鬼狒狒(mandrillusleucophaeus)(黑面山魈(drill))(鬼狒(papioleucophaeus))、苏门答腊猩猩(pongoabelii)(苏门答腊猩猩(sumatranorangutan))(婆罗洲猩猩(pongopygmaeusabelii))或姑息性安哥拉结肠杆菌(colobusangolensispalliates)的asc蛋白。

　　根据本发明的asc配体可以显示或可以不显示与不同的asc同源物的交叉反应性(cross-reactivity)，即与在两个或更多个不同物种中发现的asc同源物相互作用或结合的能力。

　　asc“同工型”包括在翻译后修饰方面与“规范”asc蛋白不同的asc蛋白。翻译后修饰(ptm)可能导致给定蛋白的共价或非共价修饰。常见的翻译后修饰包括糖基化、磷酸化、泛素化、s-亚硝基化、甲基化、n-乙酰化、脂质化、二硫键形成、硫酸化、酰化、脱氨基等。翻译后蛋白水解加工可能会改变给定蛋白的氨基酸序列。不同的ptm可以例如导致不同的化学、活性、定位、相互作用或构象，并且任选地导致不同的氨基酸序列。

　　asc“变体”包括asc蛋白“序列变体”，即包含与参比(或“亲本”)asc蛋白的参比(或“亲本”)氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同的氨基酸序列的蛋白。所述参比氨基酸序列可以优选地是根据seqidno：1的规范氨基酸序列。因此，与各自的参比序列相比，asc变体可以优选地在其氨基酸序列中包括至少一个氨基酸突变、取代、插入或缺失。取代可以是保守的(其中源自同一类别的氨基酸彼此交换)，或为非保守的。asc变体包括天然存在的变体，例如已进行翻译后蛋白水解加工的asc前蛋白原、蛋白原和asc蛋白(这可能涉及去除n末端甲硫氨酸，信号肽，和/或转化灭活或无功能蛋白为活性或功能蛋白)，以及天然存在的突变体asc蛋白。asc变体还包括“转录变体”(或：“剪接变体”)。转录变体由信使rna产生，这些信使rna最初是从同一基因转录而来，但随后进行了选择性(或差异)剪接，其中特定的基因外显子可能包含在最终加工的信使rna(mrna)中或从中排除。asc变体还包括工程化asc变体。应当指出，asc“变体”可以基本上由与参比蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸序列限定。因此，术语“变体”和“同源物”、“同工型”(当指改变氨基酸序列的翻译后修饰时)和“片段”之间可能存在一定的重叠。本文定义的“变体”可以衍生自各自的参比蛋白、分离自各自的参比蛋白、与各自的参比蛋白相关、基于各自的参比蛋白或与参比蛋白质同源。

　　示例性asc“变体”包括asc蛋白，其包括与根据seqidno:4或seqidno:5的氨基酸序列对应的氨基酸序列或由其组成。

　　asc“片段”包括asc蛋白或(多)肽，其由参比(或“亲本”)asc蛋白的全长氨基酸序列的连续子序列组成。所述参比氨基酸序列可以优选是根据seqidno：1的规范氨基酸序列。因此，就其氨基酸序列而言，“片段”与所述参比蛋白的氨基酸序列相比在n末端、c末端和/或序列内被截短。截短可分别在氨基酸水平或核酸水平上发生。换句话说，asc蛋白“片段”通常可能是全长asc蛋白氨基酸序列的较短部分。因此，片段通常由与全长氨基酸序列内的相应一段序列同一的序列组成。该术语包括天然存在的asc蛋白“片段”(例如天然存在的体内蛋白酶活性产生的片段)以及工程化的asc蛋白片段。

　　优选地，asc蛋白“片段”可以由与作为参比的asc蛋白氨基酸序列中的氨基酸的连续一段序列相对应的氨基酸的连续一段序列组成，其代表至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、和最优选至少80％的参比氨基酸序列。asc蛋白“片段”可以包含以下氨基酸序列或由其组成：asc蛋白的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少连续80个氨基酸残基、至少连续90个氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少连续125个氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少连续175个氨基酸残基、至少连续200个氨基酸残基或至少连续250个氨基酸残基。

　　关于各自的参比氨基酸序列，优选为根据seqidno:1的规范asc氨基酸序列，根据本发明的asc同源物、同工型、变体或片段可以优选地展示至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％和最优选至少95％或甚至97％的序列同一性。

　　因此，asc配体优选地能够与本文所述的asc蛋白特异性相互作用或结合。更优选地，asc配体可以能够与以根据seqidno：1的“规范”氨基酸序列为特征的asc蛋白或其同源物、同工型、变体或片段特异性地相互作用或结合。

　　通过与asc相互作用或结合，根据本发明的asc配体优选能够调谐，优选完全或部分预防、减少、抑制、干扰或阻断上述生物学功能或活性，即(1)被nlrp3炎性体招募的能力，通常通过热蛋白(pyd)结构域相互作用，(2)在nlrp3招募后螺旋状原纤维组装，(3)效应胱天蛋白酶-1的招募，通常经由card相互作用，(4)自动蛋白水解激活和随后的组装asc原纤维为大的副核asc团聚体(“斑点”)和(5)诱导淀粉样-β寡聚和团聚。

　　换句话说，根据本发明的asc配体优选充当asc的抑制剂。更优选地，根据本发明的asc配体预防、减少、抑制、干扰或阻断asc形成团聚体(或“斑点”)的能力和/或其诱导或促进淀粉样-β团聚的能力。如本文所用，表述“asc团聚体的形成”包括asc的螺旋状原纤维组装(上述#(2))和组装asc原纤维为大的副核asc团聚体(上述#(4))。asc配体可以通过预防、减少、抑制、干扰或阻断上述功能级联的任何一个步骤发挥其所需的抑制作用，最终诱导淀粉样-β团聚体的形成(#(1)-(5)，优选#(2)和/或#(4)和#(5))。asc配体的抑制作用可通过使用所附实施例中描述的方法，特别是aβ团聚试验(实施例1)进行评估。

　　因此，本发明的asc配体可以例如与asc的pyd或card结构域，特别是位于asc的pyd或card结构域内的表位相互作用或结合。本发明报道了，与card结构域中的突变相反，pyd结构域)中的突变(均能够抑制asc螺旋状原纤维组装(#(2))完全阻止了asc团聚体对淀粉样-β团聚的促进作用。不希望受具体理论的束缚，因此设想根据本发明的asc配体可以(特异性地)与ascpyd结构域或位于所述结构域内的表位相互作用或结合。所述表位可以包括“规范”asc氨基酸序列(seqidno：1)的氨基酸k21、k22和/或k26。但是，同样可以想象，asc配体与asc蛋白的其他部分(如位于card结构域或其他地方)相互作用或结合。例如，此类asc配体可通过对pyd相互作用的空间干扰或其他方式发挥其抑制功能。

　　“asc配体”可以是任何类型的分子，并且可以优选地选自抗体或编码这类抗体的核酸、核酸、蛋白、肽、适配体或小分子有机化合物。使用高通量筛选或计算机建模(insilicomodelling)可以容易鉴定asc配体。

　　抗体配体：

　　根据本发明的asc配体可以是抗体或其变体、片段或衍生物。术语“免疫球蛋白”(ig)和“抗体”在本文可互换使用。本文所用的术语“抗体”(ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(如双特异性抗体)，以及抗体变体、片段和衍生物，只要它们表现出所需的生物学功能即可，其通常是它们对预期靶标的结合亲和力。

　　“结合亲和力”或“亲和力”是生物分子(本文中：asc)与其配体/结合配偶体(本文中：抗体)之间的结合相互作用的强度。结合亲和力通常由平衡解离常数(kd)测量和报告。kd是抗体与其靶标之间的koff/kon之比。kd和亲和力成反比。结合亲和力受两个分子之间非共价分子间相互作用的影响，诸如氢键、静电相互作用、疏水力和范德华力。有许多方法测量结合亲和力和解离常数，诸如elisa、凝胶位移测定、下拉测定(pull-downassays)、平衡透析、分析超离心、spr和光谱测定。等温滴定热法(itc)。抗体asc配体可在微摩尔(mm)、纳摩尔(nm)、皮摩尔(pm)或飞摩尔(fm)范围内表现出结合亲和力。抗体asc配体可优选对它们的预期靶标表现出高结合亲和力。即，抗体asc配体可以以至少约107m-1、至少约108m-1、至少约109m-1、至少约10-10m-1、至少约10-11m-1或至少约10-12m-1的亲和力结合。

　　抗体asc配体优选地能够与其预期靶标特异性相互作用或结合。如本文其他地方所定义，术语“特异性结合”意思是指相比不同的非预期靶标，抗体更容易与其预期靶标结合。如果抗体优先结合或识别靶标，即使在非靶标的存在下，如可通过可定量测定(诸如，放射性配体结合测定、elisa、基于荧光的技术(如，荧光偏振(fp)、荧光共振能量转移(fret)或表面等离子体共振)测量，则抗体优选理解为与其靶标“特异性结合”或表现出“结合特异性”或“特异性亲和力”。“特异性结合”其靶标的抗体可以展示或可以不展示与衍生自不同物种的(同源)靶标的交叉反应性。

　　天然存在的基础抗体是由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成的异四聚体糖蛋白。一些抗体可能含有额外的多肽链，诸如igm和iga抗体中的j链。每条l链通过一个共价二硫键与h链相连，而两条h链则根据h链的同型通过一个或多个二硫键彼此相连。每个h和l链也包含链内二硫键。每条h链均包含n末端可变结构域(vh)，然后是α和γ链的每个的三个恒定结构域(ch)，以及μ和ε同型的四个ch域。每个l链在n-末端处具有可变结构域(vl)，随后在其另一端具有恒定结构域。vl与vh对齐，和cl与重链的第一个恒定结构域(ch1)对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。

　　基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的l链指定为两种明显不同类型(称为κ和λ)的一个。根据其重链恒定结构域(ch)的氨基酸序列，免疫球蛋白可指定为不同类别或同型。有五种免疫球蛋白类别：iga、igd、ige、igg和igm，分别具有指定为α、β、ε、γ和μ的重链。γ和μ类别根据ch序列和功能的相对较小差异进一步分为子类，例如，人表达以下子类：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。

　　vh和vl的配对一起形成单抗原结合位点。术语“可变的”是指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上差异很大的事实。v结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，可变性并未在可变结构域的整个范围内均匀分布。相反地，v区由约15-30个氨基酸残基的相对不变的一段序列(被称为框架区(fr))组成，其被极度可变的较短区(称为“高变区”，也称为“互补决定区”(cdr)，每个长度为大约9-12个氨基酸残基)分开。天然重链和轻链的可变结构域每个包括四个fr，主要采用β-折叠结构，并通过三个高变区连接，这三个高变区形成连接β-折叠结构并在某些情况下形成β-折叠结构一部分的环。每条链中的高变区通过fr紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出多种效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(adcc)的参与。当在本文中使用时，术语“高变区”(也称为“互补决定区”或cdr)是指抗体的氨基酸残基，其在免疫球蛋白的v区结构域内(通常是三个或四个具有极端序列变异性的短区)，其形成抗原结合位点并且是抗原结合特异性的主要决定因素。cdr残基可以基于跨物种序列可变性或抗原-抗体复合物的晶体学研究进行鉴定。

　　因此，如本文所用，术语“抗体”优选是指免疫球蛋白分子或其变体、片段或衍生物，其能够经由至少一个互补决定区与靶表位特异性结合。该术语包括单和多克隆抗体，单、双和多特异性抗体，任何同型的抗体(包括igm、igd、igg、iga和ige抗体)，以及通过任何手段获得的抗体，包括天然存在的抗体，通过在宿主生物体中免疫产生的抗体，从天然存在的抗体或通过在宿主生物体中免疫产生和通过本领域已知的生物分子方法重组产生的抗体中分离和鉴定的抗体，单克隆和多克隆抗体以及嵌合抗体，人抗体，人源化抗体，体内抗体(即在细胞中表达并任选位于特定细胞区室的抗体)，以及这些抗体中任何一种的变体、片段和衍生物。

　　如本文所用，术语“单克隆抗体”(mab)是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与包括针对不同表位的不同抗体的“多克隆”抗体制品相反，每种单克隆抗体均针对抗原上的单个表位。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以被合成而不受其他抗体的污染。形容词“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，可通过首先由kohler等人，nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备可用于本发明的单克隆抗体，或者可以在细菌或真核动物或植物细胞中使用重组dna方法制备它们(参见如，美国专利号4,816,567)。例如，还可以使用在clackson等人，nature352:624-628(1991)和marks等人，j.mol.biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。

　　“抗体变体”或“抗体突变体”是指包含氨基酸序列或由其组成的抗体，其中与参比或“亲本”抗体相比，氨基酸残基中的一个或多个已被修饰。这样的抗体变体因此可以依优先增加顺序显示与参比或“亲本”抗体或其轻或重链至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、优选至少约70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％、最优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。可以想到的氨基酸突变包括一个或多个氨基酸残基的缺失、插入或改变。突变可以位于恒定区或抗原结合区(如，高变或可变区)中。保守氨基酸突变可以是优选的，其将氨基酸改变为具有相似生化特性(如，电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。

　　抗体变体包括“嵌合”和“人源化”抗体，其中部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链(一条或多条)的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源。“人源化”抗体包含(部分或全部)衍生自非人动物(如小鼠或非人灵长类动物(如，旧大陆猴、类人猿等))的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列，它们优选能够有效介导fc效应子功能和/或在引入人体时显示出降低的免疫原性。“人源化”抗体可通过创建“嵌合”抗体(移植到人fc上的非人fab)作为起始步骤，并选择性突变分子的fab部分中的(非cdr)氨基酸来制备。可选地，可通过将源自非人动物的适当“供体”cdr编码片段嫁接到人抗体“受体”支架上，并任选性地突变(非cdr)氨基酸以获得最佳结合，来直接获得“人源化”抗体。

　　“抗体片段”包含完整抗体的一部分(即，包含抗原结合位点以及cl和至少一个重链结构域ch1、ch2和ch3的抗体)，优选地完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab′、f(ab′)2和fv片段。

　　木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”(片段，抗原结合)片段，以及残余的“fc”(片段，可结晶)片段。fab片段由完整的l链以及h链的可变区结构域(vh)和一个重链的第一恒定结构域(ch1)组成。每个fab片段在抗原结合方面是单价的，即，它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的f(ab')2片段，该片段大致对应于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的fab片段但仍能够交联抗原；和pfc'片段。f(ab')2片段可裂解为两个fab'片段。fab'片段与fab片段的区别在于在ch1结构域的羧基末端具有一些额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab'-sh是本文中fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基(一个或多个)带有游离硫醇基。f(ab')2抗体片段最初作为fab'片段对产生，它们之间具有铰链半胱氨酸。其他抗体片段及其化学片段也是已知的。fab/c或fabc抗体片段缺少一个fab区。fd片段对应于fab的重链部分，并含有c末端恒定(ch1)和n末端可变(vh)结构域。

　　“fc”片段包含通过二硫化物保持在一起的两条h链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由fc区中的序列决定，该区也被某些类型的细胞上可见的fc受体(fcr)识别。

　　“fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中，产生六个高变环(来自h和l链的每个的3个环)，这些环为抗原结合贡献了氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异性的cdr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但是以低于整个结合位点的亲和力。

　　“抗体衍生物”是修饰的抗体变体，其包括新的或另外的生物学特性或功能。可以对抗体衍生物进行化学或生物学修饰，以引入所需的生物学功能(如，通过引入或去除赋予、增强、减少或废除靶结合亲和力或特异性或酶活性的部分或结构域)、制造特性(如，通过引入赋予增加的溶解度或增强的排泄，或允许纯化的部分)或医学用途的药代动力学/药效动力学性质(如，通过引入赋予增加的稳定性、生物利用度、吸收；分布和/或减少的清除率的部分)。例如，可以修饰抗体衍生物以包含改变的糖基化模式，或可以与能够增加血清半衰期和稳定性和/或降低免疫原性的部分缀合，诸如聚乙二醇(peg)、葡聚糖、聚唾液酸(psa)、透明质酸(ha)、糊精、羟乙基淀粉(hes)、聚(2-乙基2-唑啉)(peoz)、多肽(xten技术，pasylation)、脂肪酸(脂化)或(附加)抗体fc部分。进一步抗体衍生物包括另外的治疗部分，诸如药物、毒性剂、酶或衔接结构域。因此，术语“衍生物”还包括抗体-药物缀合物。进一步抗体衍生物包括抗原结合抗体区(cdr和任选的fr区或抗体vl区)和其他蛋白结构域的融合产物。示例性融合产物是嵌合抗原受体(car)。进一步抗体衍生物包含通常通过合适的肽接头偶联的数个抗体片段。因此，抗体“衍生物”可以衍生自(并因此任选地包括)天然存在的(野生型)抗体或其变体或片段。示例性的抗体“衍生物”包括双抗体、线性抗体、单链抗体以及衍生自抗体片段、car和抗体-药物缀合物的双或多特异性抗体。本文还设想了所描述的修饰的组合。

　　也缩写为“sfv”或“scfv”的“单链fv”是抗体衍生物，其包含连接到单个多肽链中的vh和vl抗体结构域。优选地，sfv多肽在vh和vl结构域之间进一步包含多肽接头，其使sfv能够形成抗原结合所需的结构。

　　术语“双抗体”(也称为双价(或二价)单链可变片段、“双-scfv”、“二-scfv”)是指通过连接两个scfv片段(参见上段)制备的抗体衍生物，通常在vh和vl结构域之间具有短的接头(约5-10个残基)，以便实现v结构域的链间配对而不是链内配对。另一种可能性是构建具有两个vh和两个vl区的单条肽链(串联scfv)。所得的二价衍生物具有两个抗原结合位点。同样，可以生产三价scfv三聚体(也称为“三抗体”或“三抗”)和四价scfv四聚体(“四抗体”)。二价或多价抗体衍生物可以是单特异性的，即每个抗原结合位点可以针对相同的靶标。这样的单特异性二价或多价抗体或抗体片段衍生物优选表现出高结合亲和力。可选地，二价或多价抗体衍生物的抗原结合位点可以针对不同的靶标，形成双特异性或多特异性抗体衍生物。

　　“双或多特异性”抗体衍生物包含一个以上的特异性抗原结合区，每个都能够特异性结合不同的靶标。“双特异性”衍生物通常是两个“交换型”scfv片段的异二聚体，其中两个抗体的vh和vl结构域存在于不同的多肽链上。双或多特异性衍生物可以充当效应子和各自靶标之间的衔接分子，从而将效应子(如，毒素、药物和细胞因子或效应细胞(诸如ctl、nk细胞、巨噬细胞和粒细胞))招募到通常由靶细胞表达的目标抗原。因此，“双或多特异性”衍生物优选使效应分子或细胞和所需靶标紧密接近和/或介导效应子与靶标之间的相互作用。被称为双特异性t细胞接合子(engager)(bite抗体构建体)的双特异性串联二-scfv是二价和双特异性抗体衍生物的一个实例。

　　抗体的结构和性质在本领域中是众所周知的，尤其是在janeway’simmunobiology,9thed.(rev.),kennethmurphy和caseyweaver(eds),taylor&francisltd.2008中进行描述。

　　在本发明的上下文下，示例性asc配体抗体可以选自653902克隆tms-1(biolegend,sandiego,ca,u.s.a.)；al177(adipogen,ag-25b-0006-c100,liestal,switzerland)、ls-c331318-50(lifespanbiosciences)；af3805(r&dsystems)；nbp1-78977(novusbiologicals)；600-401-y67(rocklandimmunochemicals,inc.)；af3805-sp(r&dsystems)；orb160033(biorbyt)；orb223237(biorbyt)；676502(biolegend)；653902(biolegend)；mbs150936(mybiosource.com)；mbs420732(mybiosource.com)；mbs9401386(mybiosource.com)；mbs9404874(mybiosource.com)；mbs8504703(mybiosource.com)；mbs841111(mybiosource.com)；ab3607(merck)；04-147克隆2ei-7(merck)；nb300-1056(novusbiologicals)；nb100-56075(novusbiologicals)；nbp1-78978(novusbiologicals)；nbp1-78977ss(novusbiologicals)；nbp1-78978ss(novusbiologicals)；nbp1-77297(novusbiologicals)；ap07343pu-n(origenetechnologies)；ap06792pu-n(origenetechnologies)；am26452af-n(origenetechnologies)；ap32825pu-n(origenetechnologies)；ap23602pu-n(origenetechnologies)；ta306044(origenetechnologies)；3291-100(biovision)；3291-30t(biovision)；stj25245(stjohn'slaboratory)；stj91730(stjohn'slaboratory)；ls-c180180-100(lifespanbiosciences)；ls-c48292-100(lifespanbiosciences)；stj70108(stjohn'slaboratory)；stj113135(stjohn'slaboratory)；ls-c155196-100(lifespanbiosciences)；gtx22236(genetex)；gtx102474(genetex)；gtx28394(genetex)；d086-3(mblinternational)；13833s(cellsignalingtechnology)；cae04552(biomatik)；adi-905-173-100(enzolifesciences,inc.)；40618(signalwayantibodyllc)；e-ab-30582(elabsciencebiotechnologyinc.)；ab180799(abcam)；168-10230(raybiotech,inc.)；er-03-0001(raybiotech,inc.)；a3598-05b-100ug(unitedstatesbiological)；a3598-05n-50ug(unitedstatesbiological)；ap5631(ecmbiosciences)；abin1001824(antibodies-online)；2287(prosci,inc)；70r-11744(fitzgeraldindustriesinternational)；ahp1606(bio-rad)；pa1-41405(invitrogenantibodies)；pa5-19957(invitrogenantibodies)；pa5-27715(invitrogenantibodies)；pa1-9010(invitrogenantibodies)；10500-1-ap(proteintechgroupinc)；sc-514414(santacruzbiotechnology,inc.)；和sc-514559(santacruzbiotechnology,inc.)。

　　本发明的asc配体可以选自上述抗体中任一种，或其变体(诸如人源化或其他方式工程化的变体)、片段(诸如fab或fv片段)或衍生物(诸如scfv或双抗体)。提供这类变体、片段或衍生物的手段和方法在本领域中是已知的，并且尤其是在kontermann,roland；dübel,stefan(eds.)antibodyengineeringseries:springerlabmanuals2001,isbn:978-3-540-41354-7中描述。本文特别设想了由人源化抗体变体制备的片段或衍生物。

　　蛋白质或肽asc配体：

　　根据本发明的asc配体可以选自蛋白质或肽。蛋白质或肽asc配体优选结合蛋白质或肽，而不是抗体或其变体、片段或衍生物，其展示了对asc的特异性亲和力。

　　蛋白质或肽配体通常包含介导与asc的(特异性)相互作用或结合的结合结构域。这类结合结构域可以包括或衍生自fn3(纤连蛋白iii型结构域),、β-折叠框、kunitz结构域、pdz结构域(psd-95/discs-大/zo-1-结构域)、人a-结构域、重复单位结构域(诸如锚蛋白重复单位结构域)或葡萄球菌蛋白a(spa)，如sandjournalofbiotechnology.140(2009):254–269中所综述的。

　　蛋白质或肽asc配体包括天然存在的蛋白质和肽，以及其工程化变体和衍生物。

　　术语“特异性亲和力”、“变体”和“衍生物”在抗体asc配体的上下文中解释，并且经过必要的修改同样适用于蛋白质或肽asc配体。因此，衍生物包括例如嵌合融合体，其包括(任选地通过合适的肽接头)与第二氨基酸序列融合的第一氨基酸序列(蛋白质)，该第二氨基酸序列限定了对第一蛋白质的任何结构域外来的且基本不同源的结构域。该结构域可以衍生自或可以不衍生自不同物种。

　　示例性的蛋白质或肽asc配体包括可溶性受体、模拟抗体蛋白(adnectin)、anticalin、darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)、avimer、亲和体、肽适配体或其变体、片段或衍生物。

　　核酸asc配体：

　　根据本发明的asc配体可以选自核酸。

　　核酸asc配体可以是单链的或双链的或其混合物，并且包括dna和rna分子。核酸asc配体可以具有任何长度。它们可以包括或可以不包括修饰的核苷、核苷酸或磷酸二酯键。核酸asc配体可以是编码的或非编码的。

　　核酸asc配体可以是对asc表现出特异性亲和力的结合核酸。术语“特异性亲和力”在抗体asc配体的上下文中解释，并且经过必要的修改同样适用于核酸asc配体。这样的核酸asc配体可以选自适配体。

　　“适配体”或“寡核苷酸适配体”是由rna或单链dna寡核苷酸组成的小核酸配体，其折叠成三维(3d)结构。适配体通过结构识别与其靶标相互作用并与其结合，该过程类似于抗原-抗体反应的过程。如本文所用，术语“适配体”包括单价、二价和多价适配体，单特异性、双特异性和多特异性适配体，包含任选地经由合适接头与药物共价连接的适配体的适配体-药物缀合物(apdc)、与高分子量聚合物(如，peg)连接的适配体、适配体-束缚的dna纳米火车(nanotrain)(aptntr)、与载体(如，共聚物、脂质体金属纳米颗粒或病毒样颗粒)相关联的适配体、适配体-fc缀合物和适配体-sirna或适配体-mirna嵌合体(参见sunetal.moleculartherapynucleicacids(2014)3,e182，进行综述)。

　　可选地，核酸asc配体可以间接与asc功能和活性相互作用，如，通过调谐asc表达。这类核酸asc配体可以选自微小rna、sirna、shrna或反义rna。

　　“微小rna”或“mirna”是小的(～20-24个核苷酸)非编码双链rna(dsrna)，其能够将ago-2risc复合体招募到互补靶转录物上，从而优选诱导mirna介导的rnai途径。微小rna通常从原(pri)-微小rna加工成称为前(pre)-微小rna的短茎环结构，并最后加工成成熟的mirna。前-微小rna的茎的两条链都可以加工成成熟微小rna。加工后，与rna诱导的沉默复合物(risc)中的argonaute2(ago2)相关的成熟单链微小rna通常结合其胞质mrna靶标的3'utr，导致mrna转录物的翻译减少或去腺苷酸化和降解。因此，微小rna的主要功能是通过与靶mrna的互补序列结合来(负向)调节蛋白质翻译。术语“微小rna”包括mirna、成熟的单链mirna、前体mirna(前-mirna)、原始mirna转录物(原-mirna)、双链体mirna及其变体。特别设想微小rna能够与靶核酸的3'非翻译区内的靶位点结合。

　　“小干扰rna”或“sirna”是能够诱导rnai的小的(～12-35个核苷酸)非编码rna分子。sirna包含rna双链体(双链区)，该双链体是通过互补碱基与磷酸化的5'-端和羟基化的3'端(任选地带有一个或两个单链突出的核苷酸)配对而形成的。双链体部分通常包含17至29个核苷酸。sirna可以从杂交在一起的两个rna分子生成，或者可以可选地从包括自杂交部分(shrna)的单个rna分子生成。sirna的双链体部分可以但通常不包括在双链体的一条或两条链中的含有一个或多个未配对和/或错配核苷酸的一个或多个凸起，或可含有一个或多个非互补核苷酸对。sirna的一条链(称为反义链)包括与靶转录物(如，靶mrna)杂交的部分。反义链可以与靶转录物的互补区精确地互补(即，sirna反义链可以与靶序列杂交而没有单个错配、摆动碱基配对或核苷酸凸起)，或者在sirna反义链与靶转录物的互补区之间可以存在一个或多个错配、摆动(g：u)碱基配对和/或核苷酸凸起。

　　“短发夹rna”或“shrna”是包含至少两个互补部分的单链rna分子，该至少两个互补部分杂交或能够杂交以形成足够长以介导rnai的双链(双链体)结构。这些互补部分的长度通常在17～29个核苷酸之间，通常长度为至少19个碱基对。shrna进一步包含至少一个单链部分，通常长度在1～10个核苷酸之间，其形成连接形成双链体部分的互补链的环。双链体部分可以但通常不包含由一个或多个未配对核苷酸组成的一个或多个凸起。如上所述，shrna被认为是由rnai机器加工成sirna(参见上文)。因此，shrna是sirna前体，并被认为通过sirna介导的rnai途径诱导基因沉默。

　　“反义rna”或“asrna”是单链或双链rna分子，其表现与天然存在的mrna序列的一部分优选至少90％、更优选95％、和尤其100％的(dsrna的核苷酸)序列同一性。在本发明的上下文中，这种天然存在的mrna序列可以编码asc。反义rna通常表现出与编码或非编码部分的互补性，但是，在一些情况下，只要不消除反义rna结合其靶标的能力，就可存在摆动碱基(g：u)配对，核苷酸凸起和/或错配。

　　小分子asc配体：

　　根据本发明的asc配体可以选自小有机分子。所述小有机分子可以优选展示对asc的特异性亲和力。术语“特异性亲和力”在抗体asc配体的上下文中解释，并且经过必要的修改同样适用于小有机分子asc配体。

　　术语“小有机分子asc配体”包括能够直接或间接与asc相互作用的任何小有机分子化合物及其药学上可接受的盐、酯、衍生物、类似物和模拟化合物。

　　优选地，asc相互作用化合物不是酯化合物，更优选地不是咖啡酸苯基酯(cape)、capen、dhc或dmc，特别不是cape。

　　编码asc配体的核酸分子

　　在进一步方面，本发明提供了编码本文描述的asc配体的核酸分子——诸如抗体、蛋白、肽或核酸配体。“编码”asc配体的核酸分子能够在适当的条件下被表达以提供所述配体。核酸分子可以是单链的或双链的或其混合物，并且包括dna和rna分子。示例性核酸分子可选自构建体、包括有义和反义dna的基因组dna、互补dna(cdna)、异源核rna(hnrna)、前体mrna(前-mrna)、(成熟)信使rna(mrna)、dna：rna杂合分子、微型基因和基因片段。

　　本发明的核酸分子可以具有任意长度。本发明的核酸分子可以包括天然核苷(如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、c5-丙炔基胞苷、c5-丙炔基尿苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫胞苷)和/或包含化学或生物修饰的碱基(如，甲基化碱基)、插层碱基和/或修饰的糖(如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)的核苷。本发明的核酸分子可以包括磷酸二酯键，或任意其他类型的键，诸如硫代磷酸酯和5′-n-亚磷酰胺键。包含非天然存在的核苷或核苷酸、序列、主链或核苷酸间键的核酸分子在本文中也称为“修饰的”核酸分子。

　　本发明的核酸分子可以通过使用生物手段(例如，酶促地)在体内或体外获得，或者可以化学合成。

　　根据本发明的核酸分子的特征在于其多核苷酸序列。所述序列优选包含编码目标asc配体的“编码区”或“编码序列”(cds)。如本文所用，术语“编码”意思是能够在合适的环境如合适的宿主细胞中或在合适的体外条件下表达以提供所需的表达产物(如蛋白、肽或核酸)。编码asc的开放阅读框的多核苷酸序列可以很容易地从基因组dna来源、cdna来源中分离，或者可以合成(例如，通过pcr)。

　　因此，本发明的核酸分子可以包含编码本文所述的(蛋白质性质的)asc配体以及任选地与其可操作地连接的调节元件的cds或由其组成。

　　术语“可操作地连接”是指多核苷酸序列与另一多核苷酸序列的连接，使得该序列以其预期方式起作用。例如，当编码蛋白质的多核苷酸序列以使所述多核苷酸序列表达产生编码的蛋白质的功能性方式与调节元件连接时，该编码蛋白质的多核苷酸与所述调节元件“可操作地连接”。

　　术语“调节元件”和“调节序列”可互换使用，并且指能够调谐宿主细胞中可操作连接的多核苷酸序列的生物学功能或活性的多核苷酸序列。例如，调节元件包括能够指导或调谐(如，增加)来自编码蛋白质的多核苷酸序列的蛋白质表达。因此，该术语涵盖促进或调节转录的元件，包括启动子、rna聚合酶与转录因子基本相互作用所需的核心元件、剪接信号、聚腺苷酸化信号、上游元件、增强子和应答元件。能够指导原核生物中表达的调节元件包括启动子、操纵子序列和核糖体结合位点。调节元件可以是基因组(如，病毒或真核生物)来源的，或者可以是合成生成的。调节元件可以衍生自文库或数据库并经化学合成的。可以将调节元件引入本发明的核酸分子中以优化转录、mrna加工和稳定以及翻译成编码的氨基酸序列。调节元件可通过在合适的限制性位点上连接或使用本领域技术人员已知的限制性核酸内切酶通过插入序列中的接合体或接头与目标多核苷酸序列连接。

　　“启动子”或“启动子序列”是位于转录起始位点(通常在转录起始位点的上游或5′)并起始特定目标多核苷酸序列转录的核苷酸序列。启动子可以是组成型的或诱导型的。诱导型启动子仅在某些生理条件下才启动可操作连接的cds的转录，并可根据宿主细胞、所需的表达水平、宿主细胞的性质等进行控制。

　　启动子包括真核启动子、病毒启动子和合成启动子，如β-肌动蛋白启动子、sv40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒(cmv)启动子、逆转录病毒启动子等。启动子可以与或可以不与增强子缔合，其中该增强子可以与特定的启动子自然缔合或与不同的启动子缔合。

　　术语“增强子”指顺式作用核苷酸序列，其增强可操作连接的多核苷酸序列的转录并以与方向和位置无关的方式起作用。增强子可以在相对于转录起始位点的上游或下游的任何位置起作用。当增强子与启动子可操作地连接时，增强子可以包含能够增加由启动子的转录水平的任何核苷酸序列或由其组成。示例性增强子包括rsvltr增强子、杆状病毒hr1、hr2或hr3增强子或cmv立即早期基因产物增强子。

　　可以将“标记”引入本发明的核酸分子中，以使得能够检测或选择已经被本发明的核酸分子和/或载体成功转化(即包含本发明的核酸分子和/或载体)的宿主细胞。标记通常是基因，将其引入宿主细胞后会表达显性表型，从而可以对携带该基因的细胞进行阳性选择或检测。这种类型的基因是本领域已知的，尤其包括绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶(β-gal)、β-葡萄糖醛酸酶、潮霉素b磷酸转移酶基因(hph)、氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、腺苷脱氨酶基因(adenosinedaminasegene)(ada)和多药耐药性(mdr)基因。

　　进一步，目标调控元件包括“复制起点”(“ori”)，其赋予了在期望的宿主细胞中复制的能力。任选地，核酸分子可以包含调节元件，其影响连接或插入期望的宿主细胞中。

　　载体

　　在进一步方面，本发明提供包含根据本发明的核酸分子的载体。换句话说，本发明提供包含编码本文描述的asc配体——诸如抗体——的多核苷酸序列的载体。

　　“载体”(本文中也称为“媒介物”或“构建体”)是用作转移、表达、复制、增殖、整合和/或存储目标多核苷酸序列的媒介物的核酸分子。

　　根据本发明的载体可以选自病毒或非病毒载体。

　　非病毒载体包括质粒(整合的或非整合的)、质粒小环、转座子、粘粒和人工染色体，例如细菌人工染色体(bac)和酵母人工染色体(yac)。这样的非病毒载体可以与聚合物或脂质复合，或者可以以“裸”rna或dna的形式提供。

　　病毒载体包括逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、腺病毒和腺伴随病毒。逆转录病毒、慢病毒和腺伴随病毒整合到宿主细胞dna中，并因此具有在宿主中长期表达的潜力。逆转录病毒可以选自鼠白血病病毒(mlv)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、劳斯肉瘤病毒(rsv)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、藤浪氏肉瘤病毒(fusv)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(mo-msv)、埃布尔森鼠白血病病毒(a-mlv)和禽成红细胞瘤病毒(aev)。慢病毒可以选自人类免疫缺陷病毒(hiv)、猿猴免疫缺陷病毒(siv)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血病毒(eiav)、山羊关节炎脑炎病毒(caev)、牛免疫缺陷病毒(biv)和基于空泡病病毒(jembranadiseasevirus)(jdv)的载体。腺病毒可以选自第一代和第二代5型腺病毒以及无肠载体。腺伴随病毒可以选自所有腺伴随血清型。

　　根据本发明的载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或者作为独立的遗传元件(如，附加体、质粒)存在。载体可以作为单个核酸分子或作为两个或更多个分开的核酸分子存在。载体可以是单拷贝载体或多拷贝载体(指示通常在宿主细胞中维持的载体的拷贝数)。载体通常是重组的，即自然界中不存在的人工分子。载体可以以直线和/或环状形式存在。一些环状核酸载体可以在递送到细胞中之前被有意地直线化。

　　可以使用本领域中已知的方法将编码本发明的asc配体的多核苷酸序列插入载体“主链”中(参见sambrookjetal.,2012(4thed.),molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,newyork)。这些方法可以包括体外重组dna和合成技术以及基因重组。所得的载体被称为“重组”载体，因为其包含来自供体基因组的核酸序列与载体核酸序列的新组合。可以通过已知技术鉴定包含所需多核苷酸序列的重组载体，所述技术包括(a)测序；(b)核酸杂交；(c)“标记”基因功能的存在或不存在；和(d)插入的多核苷酸序列的表达。

　　载体可以在其“主链”中包含另外的调节元件，如复制起点、增强子、限制性位点或调节元件，如本文其他地方所述的。载体可包含指导其连接和整合入宿主细胞基因组等的调节序列。

　　根据本发明的载体可以选自存储载体、克隆载体、转移或穿梭载体、表达载体、基因治疗载体和其他载体。如将容易理解的，以上定义可以在一定程度上重叠，如，一些转移载体也可以作为表达载体起作用。

　　优选地，根据本发明的载体可以是基因治疗载体或表达载体。

　　“表达载体”是能够实现编码的表达产物表达的载体。“表达载体”通常是重组核酸分子，其包含以“表达弹夹”形式编码目标表达产物的一个或多个多核苷酸序列。“表达弹夹”包括所述多核苷酸序列(一个或多个)和促进所述多核苷酸序列(一个或多个)有效转录的适当调节元件。通常将其插入载体主链中的多个克隆位点。合适的调节元件可包括转录启动子和任选的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。表达载体的选择将受到宿主表达系统选择的影响。用于稳定转化的表达载体通常具有可选择标记，其允许选择和维持转化的细胞。在一些情况下，复制起点可用于扩增载体的拷贝数。

　　“基因治疗载体”是可以转移至待治疗的对象的载体，在对象中其实现多核苷酸序列的表达。

　　宿主细胞

　　在进一步方面，本发明提供了包含根据本发明的asc配体、核酸分子和/或载体的宿主细胞。

　　合适的宿主细胞的选择取决于它们期望的用途和功能。

　　本发明尤其设想用于表达编码根据本发明的asc配体的核酸分子和/或载体的多核苷酸序列的宿主细胞。可以使用多种宿主-载体系统来表达编码asc配体的多核苷酸序列。这些包括用病毒(如牛痘病毒、腺病毒和其他病毒)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，诸如含酵母载体的酵母；或用噬菌体、dna、质粒dna或粘粒dna转化的细菌。

　　更具体地，宿主细胞可以选自原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

　　原核细胞，例如大肠杆菌，可以用于产生大量的(蛋白质性质的)asc配体。大肠杆菌的转化是本领域技术人员众所周知的简单而快速的技术。大肠杆菌的表达载体可包含诱导型启动子，例如，用于诱导高水平的蛋白表达和用于表达对宿主细胞显示一些毒性的蛋白。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、t7和sp6rna启动子以及温度调节的λpl启动子。

　　(蛋白质性质的)asc配体可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。可选地，可以将前导序列融合至所需的蛋白质产物，从而将蛋白质引导至氧化性周质空间。前导通常被周质内部的信号肽酶去除。靶向周质的前导序列的实例包括来自果胶酸裂合酶基因的pelb前导和源自碱性磷酸酶基因的前导。在一些情况下，周质表达允许表达的蛋白质泄漏到培养基中。蛋白质的分泌允许从培养上清液中快速并简便的纯化。可以通过渗透裂解从周质中获得未被分泌的蛋白质。与细胞质表达类似，在一些情况下，蛋白质可能会变得不溶，而变性剂和还原剂可用于促进溶解和重折叠。可使用还原剂(诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇)和变性剂(诸如胍-hcl和尿素)来增加表达的蛋白质产物的溶解度。诱导和生长的温度也可以影响表达水平和溶解度，通常使用25℃至37℃之间的温度。通常，细菌产生无糖基化的蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化才能发挥功能，则可以在从宿主细胞中纯化后在体外添加糖基化。

　　酵母细胞(诸如酿酒酵母、裂殖酵母、解脂耶氏酵母、乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母)是众所周知的酵母表达宿主，其可用于产生蛋白质，诸如本文所述的(蛋白质性质的)asc配体。可以用附加型复制载体或通过同源重组的稳定染色体整合来转化酵母细胞。通常，诱导型启动子被用于调节基因表达。这种启动子的实例包括gal1、gal7和gal5和金属硫蛋白启动子，诸如cup1、aox1或其他毕赤酵母或其他酵母启动子。表达载体可以包括可选择标记，诸如leu2、trp1、his3和ura3，用于选择和维持转化的dna。酵母中表达的蛋白质通常是可溶的。与伴侣蛋白(诸如bip和蛋白二硫键异构酶)的共表达可改善表达水平和溶解度。另外，可以使用分泌信号肽融合物(诸如来自酿酒酵母的酵母交配型α因子分泌信号)和与酵母细胞表面蛋白(例如aga2p交配粘附受体或阿糖胞苷葡糖淀粉酶)的融合物来指导在酵母中表达的蛋白质进行分泌。可以对诸如kex-2蛋白酶的蛋白酶切割位点进行工程化，以在它们离开分泌途径时从表达的多肽中去除融合序列。酵母还能够在asn-x-ser/thr基序处进行糖基化。

　　昆虫细胞表达系统表达高水平的蛋白质，并且能够进行高级真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，其提高了安全性并减少了对真核表达的调节关注。典型的表达载体使用用于高水平表达的启动子，例如杆状病毒的多角体基因启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒，诸如苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus)(acnpv)和家蚕核型多角体病毒(bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus)(bmnpv)和昆虫细胞系，诸如来自草地贪夜蛾的sf9、一星黏虫(pseudaletiaunipuncta)(a7s)和黑脉金斑蝶(dpn1)。为了高水平表达，可以就在病毒的多角体基因起始密码子的下游融合待表达的分子的核苷酸序列。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中得到精确加工，并且可用于将表达的蛋白质分泌到培养基中。此外，细胞系一星黏虫(a7s)和黑脉金斑蝶(dpn1)产生的蛋白质具有类似于哺乳动物细胞系统的糖基化模式。

　　昆虫细胞中的可选的表达系统是使用稳定转化的细胞。可以使用诸如schneider2(s2)和kc细胞(黑腹果蝇)和c7细胞(白纹伊蚊)等的细胞系进行表达。果蝇金属硫蛋白启动子可用于在镉或铜的重金属诱导的存在下诱导高水平表达。通常通过使用诸如新霉素和潮霉素的可选择标记来维持表达载体。

　　表达载体可以通过病毒感染(诸如腺病毒)或通过直接dna转移(诸如脂质体、磷酸钙、deae-葡聚糖)以及通过物理手段(例如电穿孔和显微注射)转移至哺乳动物细胞。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括mrna帽位点、tata盒、翻译起始序列(kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。也可以添加ires元件以允许与另一个基因(诸如可选择标记)的双顺反子表达。这样的载体通常包括用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如sv40启动子-增强子、人巨细胞病毒(cmv)启动子和劳斯肉瘤病毒(rsv)的长末端重复序列。这些启动子-增强子在许多细胞类型中都有活性。组织和细胞型启动子和增强子区也可以用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自下述基因的那些，诸如弹性蛋白酶1、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、α甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺素释放素基因对照。可选择标记可用于选择和维持带有表达构建体的细胞。可选择标记基因的实例包括但不限于潮霉素b磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(dhfr)和胸苷激酶。例如，可以在氨甲蝶呤存在下进行表达以仅选择表达dhfr基因的那些细胞。与细胞表面信号传导分子如tcr-ζ和fcεri-γ融合可指导蛋白质在细胞表面以活性状态表达。

　　许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性细胞系包括但不限于cho、balb/3t3、hela、mt2、小鼠ns0(非分泌)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异源杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、sp2/0、cos、nih3t3、hek293、293s、2b8和hkb细胞。还可用适用于无血清培养基的细胞系，该培养基有助于从细胞培养基中纯化分泌的蛋白质。实例包括cho-s细胞(invitrogen,carlsbad,calif.,目录号#11619-012)和无血清ebna-1细胞系(phametal.,(2003)biotechnol.bioeng.84:332-342)。还可用适合在针对最大表达进行优化的特殊培养基中生长的细胞系。例如，dg44cho细胞适合在化学成分确定的无动物产品培养基中的悬浮培养物中生长。

　　转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质，诸如本文所述的任何蛋白质。通常使用直接dna转移如微粒轰击(microprojectilebombardment)和peg介导转移入原生质体以及农杆菌介导的转化，将表达载体转移至植物。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常分为双子叶植物宿主(例如拟南芥和烟草)和单子叶植物宿主(例如玉米和水稻)。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖双磷酸羧化酶启动子以及泛素和ubq3启动子。诸如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶的可选择标记通常用于促进转化的细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以作为细胞、团聚体(愈伤组织)维持在培养物中，或者可以再生成完整的植物。转基因植物细胞还可以包括经工程改造以产生透明质酸酶多肽的藻类。由于植物的糖基化模式不同于哺乳动物细胞，因此这可影响这些宿主中产生的蛋白质的选择。

　　(蛋白质性质的)asc配体可以使用本领域已知的任何合适的技术从宿主细胞中纯化。分泌的蛋白质通常在去除细胞后从培养基中纯化。细胞内表达的蛋白质通常在宿主细胞裂解后从细胞提取物中纯化。纯化技术可能涉及sds-page、尺寸分级和尺寸排阻色谱、硫酸铵沉淀和离子交换色谱(例如阴离子交换)。亲和力纯化技术也可以用于纯化抗体或其他蛋白质或肽。所述抗体或蛋白质或肽也可以被工程化以添加亲和力标签，诸如myc表位、gst融合物或his6，并能够分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和ni-树脂进行亲和力纯化。可以通过本领域已知的任何方法来评估纯度，其包括凝胶电泳以及染色和分光光度技术。

　　(药物)组合物

　　在进一步方面，本发明提供了一种组合物，其包含本文所述的asc配体、核酸、载体或宿主细胞中任一种，或其组合，以及任选地至少一个药学上可接受的赋形剂。该组合物可以优选地是药物组合物。药物组合物通常是根据对监管机构或根据公认的药典制备的用于动物和人类的其他机构的批准而制备的。

　　出于生产增强、患者可接受性、改善稳定性、控制释放等目的，可以添加赋形剂。通常，赋形剂是药物组合物的主要成分，活性剂仅以相对少量存在。有时，赋形剂也称为“非活性”或“惰性”成分。但是，一些赋形剂也可能对药代动力学或药效动力学产生影响，尤其是对共同施用活性剂的吸收、分布、代谢和消除(adme)过程产生影响。

　　赋形剂通常基于其在药物制剂中的作用以及基于影响药物递送的相互作用——基于其化学和物理化学性质进行分类。赋形剂的主要类别包括抗氧化剂、包衣材料、乳化剂(emulgent)、味道和气味改善剂、软膏基质、防腐剂、稠度改善剂、崩解材料、稀释剂、填料、膨胀剂、载体、粘合剂、润滑剂、助流剂、溶剂和助溶剂、缓冲剂、润湿剂、消泡剂、增稠剂和保湿剂。一些赋形剂可以起到多种作用；例如，甲基纤维素是包衣材料，用于制备悬浮液，以增加粘度，作为片剂中的崩解剂或粘合剂。

　　术语“药学上可接受的”是指与一种或多种活性剂相容并且不干扰和/或基本上降低其/它们的药学作用的化合物。药学上可接受的赋形剂优选具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适合与活性剂(一种或多种)共同施用至对象。

　　合适的药学上可接受的赋形剂的选择通常由药物组合物的选择施用途径和制剂决定。

　　根据本发明的药物组合物可以通过皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、腹膜内、血管内(i.v.)、鼻内、透皮、病变内、肿瘤内、颅内、肺内、心内、舌下、直肠、颊或阴道施用途径进行施用。适用于这种途径的制剂是本领域技术人员已知的。施用可以是局部的或者是全身的。可以通过(例如但不限于)手术过程中的局部输注、外部应用(例如结合手术后的伤口敷料)、通过注射、借助导管、借助栓剂或借助植入物实现在需要治疗的面积中的局部施用。全身施用可以通过口服施用或通过注射来实现，所述注射可以是无针注射(喷射注射)和/或针注射。

　　药物组合物可以配制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、栓剂、无菌肠胃外溶液或混悬剂、口服溶液或混悬剂、油水乳剂和缓释制剂。制剂应适合于施用模式。根据本发明的药物组合物也可以作为冻干粉剂提供，其可以重构为溶液、乳液和其他混合物进行施用。它们也可以被重构并配制成固体或凝胶。

　　用于外部施用的药物组合物可以配制成乳膏、凝胶剂、软膏剂、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气溶胶、灌洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂、气雾剂或任何其他适于外部施用的制剂。用于直肠施用的药物组合物可以配制成直肠栓剂、胶囊剂和片剂。用于口服施用的药物组合物可以配制成片剂或胶囊剂。药物组合物也可以通过控释制剂和/或递送装置进行施用。根据本发明的(药物)组合物可以以液体、固体或半固体形式配制。

　　根据本发明的药物组合物可以以单位剂型或多倍剂型提供。每个单位剂量通常包含有效量的活性剂(一种或多种)，以及所需的药学上可接受的赋形剂。单位剂型的实例包括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或胶囊。单位剂量的肠胃外制剂可以包装在例如安瓿、药筒、小瓶或带针的注射器中。单位剂型可以以其分数或倍数施用。多倍剂型是包装在单个容器中的多个相同的单位剂型，以便以分开的单位剂型施用。多倍剂型的实例包括小瓶、片剂或胶囊剂的瓶、或品脱或加仑的瓶。因此，多倍剂型是在包装中没有分开的多个单位剂量。

　　优选地肠胃外施用本发明的asc配体。

　　肠胃外施用可以通过注射或输注来完成，如，皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射或输注。可选地，肠胃外施用可以通过吸入来实现。肠胃外施用的药物组合物可以制备成液体溶液或悬浮液、乳剂或能够在施用前在合适的液体介质中重构的固体形式。肠胃外施用的药物组合物通常存储在小瓶、静脉输液袋(ivbag)、安瓿、药筒或预装注射器中。

　　肠胃外施用的药物组合物优选地包括易于施用的无菌溶液、悬浮液或乳剂或其浓缩形式，在使用前其必须在合适的溶剂中稀释。溶液、悬浮液和乳液可以是水性或非水性的。

　　水性媒介物的实例包括氯化钠注射剂、林格注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注射剂、右旋糖和乳酸林格注射剂。非水性媒介物包括植物来源的不挥发油、杏仁油、油性酯、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。液体药物组合物可进一步包含缓冲剂、润湿剂、乳化剂、稳定剂、溶解度增强剂、抗微生物剂、等渗剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、乳化剂、隔离剂或螯合剂。抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵、山梨酸和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉药包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(吐温80)。金属离子的隔离剂或螯合剂包括edta或环糊精。增稠剂和增溶剂包括葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇。悬浮剂包括山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪。乳化剂包括卵磷脂或阿拉伯胶。进一步感兴趣的赋形剂包括用于与水混溶的媒介物的聚乙二醇和丙二醇；用于ph调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。

　　用于静脉内施用的液体药物组合物优选是无菌的和等渗的。合适的赋形剂优选地包括无菌和等渗的水性媒介物，诸如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)作为载体，以及增稠剂或增溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇。

　　药物组合物可包含递送系统，诸如脂质体、脂质纳米颗粒、脂质复合物(lipoplexes)、微粒或微胶囊。

　　药物组合物可进一步包含可用于治疗或预防本文定义的神经变性疾病的额外活性剂。此类额外活性剂可以选自促智剂、神经保护剂、抗帕金森病药物、淀粉样蛋白沉积抑制剂、β淀粉样合成抑制剂、抗抑郁剂、抗焦虑药、抗精神病药和抗多发性硬化症药物、或其组合。

　　试剂盒

　　在进一步方面，本发明涉及包含根据本发明的asc配体、核酸、载体、宿主细胞、药物组合物或其任何组合的试剂盒或部分试剂盒(kit-of-parts)。任选地，试剂盒可额外包含如“(药物)组合物”部分中所述的药学上可接受的赋形剂或进一步活性剂。

　　asc配体、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物可以以任何合适形式如以液体或冻干形式提供。

　　试剂盒或部分试剂盒可以是两个或更多个部分的试剂盒，并且通常在合适的容器中包含其组分。例如，每个容器可以是小瓶、瓶、挤压瓶、广口瓶、密封套筒、包封或小袋、试管或泡罩包装的形式，或任何其他合适的形式，只要该容器被配置为防止成分的过早混合即可。可以分别提供每种不同的成分，或者可以将一些不同的成分一起提供(即，在同一容器中)。

　　容器也可以是小瓶、试管、广口瓶或包封内的隔室或腔室，或者是套筒、泡罩包装或瓶，条件是在由药剂师或医师有意混合之前一个隔室的内容物不能与另一个隔室的内容物在物理上相关联。

　　此外，试剂盒或部分试剂盒可以含有具有关其任何成分的使用、施用和剂量的信息的技术说明书。

　　医疗使用和治疗

　　在进一步方面，本发明涉及治疗神经变性疾病的方法，该方法包括向有需要的对象施用有效量的根据本发明的asc配体、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物，或其任何组合。

　　这样的方法可以包括在向对象施用有效量的本发明的asc配体、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物之前制备本发明的asc配体、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物的任选的第一步骤。

　　神经变性疾病：

　　本发明提供了用于治疗或预防神经变性疾病的asc配体。神经变性疾病通常是慢性进行性疾病，其特征在于中枢神经系统(cns)例如脑的离散区域中的神经元逐渐丢失。

　　设想通过使用本发明的asc配体进行治疗或预防的神经变性疾病可以优选地特征在于痴呆和/或伴有痴呆。“痴呆”是心智能力下降的通用术语，其严重程度足以干扰日常生活。痴呆可包括记忆力、沟通和语言、聚焦和专注的能力、推理和判断、视觉感知或其组合下降或丧失。它可能由多种神经变性疾病中的神经变性引起。

　　本发明人发现，在先天免疫炎症事件过程中能够阻断其团聚的asc配体可用于预防或减少脑内aβ-斑块的形成。因此，特别设想根据本发明的asc配体用于治疗特征在于和/或伴有aβ相关病理学的神经变性疾病。术语“aβ相关病理学”是指脑中淀粉样β的异常产生、沉积和团聚。

　　优选地，所述神经变性疾病选自阿尔兹海默症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症、髓脑小脑性共济失调、额颞痴呆、额颞叶变性、轻度认知障碍、帕金森叠加综合症、皮克病、进行性孤立性失语症、灰质变性[alpers]、亚急性坏死性脑病或路易体痴呆，尤其优选阿尔兹海默症。

　　“阿尔兹海默症”(“ad”)是神经变性脑病，其是老年人中痴呆的主要原因。ad的症状可能包括学习和记忆功能的逐步丧失、人格改变、神经肌肉改变、癫痫发作以及偶发的精神病行为。阿尔兹海默症的特征在于淀粉样-β斑块沉积在脑区域中，这些区域对于记忆和其他认知功能至关重要。据认为，淀粉样β斑块在脑的这些关键区域中的沉积干扰脑的功能。

　　然而，根据本发明的asc配体的用途并不一定限于以aβ-斑块形成为特征的神经变性疾病。asc是实现多种生物学功能的衔接蛋白。因此，其他神经变性疾病也有望用本发明的asc配体进行治疗或预防。

　　根据本发明设想治疗或预防的进一步神经变性疾病包括遗传性共济失调、先天性非进行性共济失调、早发性小脑性共济失调、晚发性小脑性共济失调、伴有缺陷性dna修复的小脑性共济失调、遗传性痉挛性截瘫、婴儿性脊髓性肌萎缩、i型韦-霍二氏病[werdnig-hoffman]、遗传性脊髓性肌萎缩症、主要影响中枢神经系统的系统性萎缩症、副肿瘤性神经肌病和神经病、脊髓灰质炎后综合征、基底神经节变性疾病、哈-斯二氏病、进行性核上眼肌麻痹[斯-里-奥三氏病]、神经源性体位性低血压[希-德二氏病]、肌张力障碍、震颤、舞蹈病、不安腿综合征、僵硬综合征、锥体束外和运动障碍、多发性硬化症、急性弥漫性脱髓鞘、视神经脊髓炎[德维克病]、急性和亚急性出血性脑白质炎[赫斯特病]、周围性脑炎、谢耳德氏病、胼胝体中心性脱髓鞘、中央脑桥髓鞘溶解、中枢神经系统脱髓鞘疾病的急性横贯性脊髓炎、亚急性坏死性脊髓炎、同心性硬化、癫痫症、局部相关的(局灶性)(部分)特发性癫痫和伴局部癫痫发作的癫痫综合征、局部相关的(局灶性)(部分)的症状性癫痫和伴简单部分发作的癫痫综合征、局部相关的(局灶性)(部分)的症状性癫痫和伴复杂部分发作的癫痫综合征、婴儿期肌阵挛性癫痫、新生儿惊厥(家族性)、童年失神癫痫[类癫痫发作]、失神癫痫、肌阵挛性癫痫[冲动性癫痫小发作]、伴有肌阵挛性失神的癫痫、肌阵挛性静息性癫痫发作、小儿痉挛、伦-加二氏综合征、萨拉姆发作、有症状的早期肌阵挛性脑病、韦斯特综合征、持续性不全癫痫[kozhevnikof]、癫痫大发作、癫痫小发作、癫痫持续状态、癫痫大发作状态、癫痫小发作状态、复杂性部分癫痫状态、偏头痛、丛集性头痛综合征、血管性头痛、紧张型头痛、慢性创伤后头痛、发作性睡眠和猝倒、克-列二氏(kleine-levin)综合征。

　　“治疗”或“处理”包括以下目标：(1)预防在尚未诊断出患有不期望症状或病理状态的对象中不期望的症状或病理状态发生；(2)抑制不期望的症状或病理状态，即阻止其发展；或(3)改善或缓解不期望症状或病理状态，即使得不期望症状或病理状态消退。

　　本发明的asc配体、核酸分子、载体、宿主细胞和(药物)组合物可以用于人类，并且也可以用于兽医医学目的，优选用于人类医学目的。因此，本文所用的术语“对象”、“患者”或“个体”通常包括人类和非人类动物，并且优选地包括哺乳动物(如，非人类灵长类动物，包括绒猴、绢毛猴、蜘蛛猴、枭猴、黑长尾猴、松鼠猴、和狒狒、猕猴、黑猩猩、猩猩、大猩猩；牛；马；棉羊；猪；鸡；猫；狗；小鼠；大鼠；兔；豚鼠等)，包括嵌合和转基因动物和疾病模型。在本发明的上下文中，术语“对象”优选是指非人灵长类动物或人，最优选是指人。

　　“有效量”意思是足以在所寻求的组织、系统、动物或人类中引起期望的生物学或医学应答的活性剂(一种或多种)或组合物的量。因此，“有效量”优选地足以诱导待治疗的疾病的阳性改变，即，减轻所治疗的疾病的症状、减轻疾病的进展或预防所预防的疾病的症状。然而，同时，“有效量”优选是安全的，即足够小以避免严重的副作用，也就是说，允许有利与风险之间的合理的关系。通常，“有效量”可能会关于待治疗的特定病症以及待治疗的患者的年龄、身体条件、体重、性别和饮食，病症的严重程度，治疗的持续时间，共同治疗的性质，所用的具体药学上可接受的赋形剂，治疗方案和类似因素而改变。“有效量”可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序确定，如，用于确定ld50(对50％的群体致死的剂量)和ed50(对50％的群体治疗有效的剂量)。适用于确定“有效量”的示例性动物模型包括但不限于兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人类灵长类动物模型。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为ld50/ed50之比。通常优选表现出大治疗指数的活性剂或组合物。从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括很少或没有毒性的ed50的循环浓度范围内。在本发明的上下文中，“有效量”范围可以为约0.001mg至10mg、约0.01mg至5mg、约0.1mg至2mg每剂量单位或约0.01nmol至1mmol每剂量单位，诸如1nmol至1mmol每剂量单位，或1μmol至1mmol每剂量单位。“有效量”范围还可以在(每kg体重)约0.01mg/kg至10g/kg、约0.05mg/kg至5g/kg、或约0.1mg/kg至2.5g/kg。

　　可以通过皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、腹膜内、血管内(i.v.)、鼻内、透皮、病变内、肿瘤内、颅内、肺内、心内、舌下、直肠、颊或阴道施用途径来完成施用。施用可以是局部的或者是全身的。可以通过(例如但不限于)手术过程中的局部输注、外部应用(如)结合手术后的伤口敷料、通过注射、借助导管、借助栓剂或借助植入物实现在需要治疗的面积中的局部施用。全身施用可以通过口服施用或通过注射来实现，所述注射可以是无针注射(喷射注射)和/或针注射。

　　asc配体、核酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物可以每天多次、每天、每隔一天、每周或每月向有需要的对象施用。

　　asc配体、核酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物，以及“药物组合物”部分中描述的任选其他活性剂顺序(在不同时间通过相同或不同的施用途径)或同时(在相同时间通过相同或不同的施用途径)或在相同的药物组合物中。顺序施用方案也称为“时间错开(time-staggered)”施用。时间错开施用包括如下方案，其中在第二剂量的相同asc配体、核酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物，或一定剂量的另一活性剂(其可以是本发明的asc配体、核酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物或另一活性剂)之前、同时或之后，施用第一剂量的asc配体、核酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物。

　　编码根据本发明的asc配体的核酸或载体也可以用于基因治疗。“基因治疗”通常是指出于治疗目的而对基因组进行的操作，并且包括使用基因组编辑技术来校正导致疾病的突变，向基因组中添加治疗基因，去除有害基因或基因组序列，以及调谐基因表达。基因治疗可能涉及对象细胞的体内或离体转化。例如，可以将编码根据本发明的asc配体的核酸或载体施用至患有神经变性疾病的对象，在该对象中它们被表达以产生编码的asc配体。通常，核酸可以以合适的载体的形式递送至对象，所述载体能够转移和表达编码的asc配体。这样的载体在本文其他地方描述，并且包括如病毒载体。可选地，核酸可以以“裸”形式递送，或与脂质、聚合物或其他合适的复合剂复合。

　　诊断方法和试剂盒

　　本发明进一步涉及利用针对asc团聚体的自身抗体的存在的诊断方法。本文所述的诊断用途和方法可使用待诊断的对象的分离样品在体内或体外进行。

　　因此，在进一步方面，本发明涉及包含card的凋亡相关斑点样蛋白质(asc)，其用于诊断对象中神经变性疾病或发展成神经变性疾病的风险的方法中，所述方法包括(i)使所述样品与asc蛋白或其同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体接触，所述asc蛋白包含对应于seqidno：1的氨基酸序列或由其组成，和(iii)检测分析物与所述asc蛋白或其同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体的结合。

　　此外，本发明还涉及诊断对象中神经变性疾病或发展成神经变性疾病的风险的方法，所述方法包括(i)任选地从怀疑患有所述疾病或处于发展所述疾病风险下的对象中收集样品；(ii)使所述样品与asc蛋白或其同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体接触，所述asc蛋白包含对应于seqidno：1的氨基酸序列或由其组成，和(iii)检测分析物与所述asc蛋白或其同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体的结合。

　　诊断用途和方法可涉及在固体支持物上提供所述asc结合蛋白或其同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体。可以使用众所周知的技术完成分析物检测，其包括免疫扩散、免疫印迹技术、免疫荧光、酶免疫测定和基于多重磁珠测定的流式细胞术。

　　分析物可以优选是自身抗体。自身抗体是如此抗体，其识别或结合产生所述抗体的宿主的抗原。本发明人提出人抗asc团聚体抗体可以防止淀粉样-β肽在脑中的交叉播种(cross-seeding)。然而，在衰老相关的免疫衰老过程中，抗体生成和免疫监视的受损可能会导致针对asc团聚体的自身抗体的降低水平的生产，并从而导致较高风险的淀粉样-β团聚。因此，内源性抗asc团聚体抗体滴度可用作疾病进展的可能标记，尤其是在诸如阿尔兹海默症之类的神经变性疾病的临床沉默前期(pre-stage)。

　　因此，诊断用途和方法可以包括定量样品中的分析物并且任选地将所述量与参比进行比较的进一步步骤。

　　参比可以是诸如通过对健康对象或源自所述健康对象的样品进行相同的诊断方法获得的抗体滴度的值。参比可以源自与待诊断的对象不同的对象，或者可以源自已经在较早的时间点诊断的相同对象。参比也可以是诸如来自多个健康对象的抗体滴度之类的值，例如，中值。

　　与参比相比，待诊断的对象中分析物或源自所述待诊断的对象的样品的量减少指示神经变性疾病或发展所述疾病的风险。据认为，衰老过程中降低的免疫监视和自身抗体产生增加淀粉样-β团聚的风险。

　　因此，本文所述的诊断用途和方法可以优选地特征在于或伴有asc团聚和/或淀粉样-β团聚的存在。

　　优选地，所述神经变性疾病可以选自阿尔兹海默症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化症、髓脑小脑性共济失调、额颞痴呆、额颞叶变性、轻度认知障碍、帕金森叠加综合征、皮克病、进行性孤立性失语症、灰质变性[alpers]、亚急性坏死性脑病或路易体痴呆，尤其优选阿尔兹海默症。

　　本发明进一步提供了用于执行本文所述的诊断方法和用途的诊断试剂盒，其包含asc蛋白或asc团聚体以及用于检测自身抗体与所述蛋白或团聚体结合的检测