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细胞工程十篇
细胞工程篇1
“细胞工程”是人教版新课程教材《生物选修3•现代生物科技专题》的教学内容,根据操作对象的不同,可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。本部分内容是从细胞水平和分子水平了解植物细胞工程和动物细胞工程。细胞的全能性是植物细胞工程的基础,植物组织培养技术是植物细胞工程的基本技术手段,是植物体细胞杂交与单倍体育种的基础。动物细胞培养技术是核移植、细胞融合与单克隆抗体等技术手段的基础。本部分内容以必修1中的细胞学、必修2中的遗传学,以及必修3中的内环境与稳态等知识为基础,为“胚胎工程”、“生物技术的安全性和伦理问题”的后续学习打下了基础,共同构成一个相对完整的知识体系。
〖学生分析〗
高二的学生已经掌握了一定的生物学基础知识,具备了一定独立思考和判断的能力,合作性学习能力也比较强,但是个体之间仍然存在着较大的差异。
〖重、难点分析〗
1.植物组织培养是本节的重点
分析:植物组织培养重点讲述植物组织培养技术和基本原理,即离体培养的植物细胞脱分化和再分化过程,不仅在知识上对细胞结构、功能、细胞增殖、细胞分化进行深化和扩展,而且还为培育无病菌植株、制备人工种子及植物体细胞杂交等提供技术支持。同时,随着科学技术的不断进步,植物组织培养这门新技术将日益普及和深入,成为现代农业生产中的重要技术手段。
2.植物体细胞杂交是本节的难点
分析:植物体细胞杂交是在植物组织培养技术的基础上,借助动物细胞融合的方法发展起来的一门新型生物技术。这部分知识对于学生来说是全新的,因此应用表格和动物细胞融合比较学习。
3.单克隆抗体是本节的重点、难点
分析:动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、核移植等。其中动物细胞培养是其他技术(单抗、细胞融合、核移植等)的基础,其价值更多是通过其他技术成果来体现的。而动物细胞融合技术是目前较成熟的、其最重要的用途便是制备单克隆抗体。可见单克隆抗体应列为本节的重点内容,同时单克隆抗体技术本身环节多,技术复杂,因此也列为本节的难点所在。
〖设计理念〗
从新旧知识联系入手,进一步深入学习细胞全能性理论,并在学习过程中,渗透对学生能力和学习方法的培养;充分利用学生现有的知识,借助于多种直观教学手段,特别是多媒体课件,使学生对植物体细胞杂交和单克隆抗体由点及面的学习;智能训练,实现知识的正向迁移。
〖教学目标〗
1.知识目标
(1)细胞全能性(理解)。
(2)植物细胞工程的主要技术――植物组织培养和植物体细胞杂交(知道)。
(3)动物细胞工程的主要技术――动物细胞培养、动物细胞融合、核移植(知道)、单克隆抗体(知道)。
2.道德目标
通过向学生介绍几大动植物细胞工程技术的发展动态及一些新的研究成果,使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入,知识不断更新并向前发展。认识到学无止境,形成终生学习的意识。
3.能力方面
在教学过程中,合理利用图表、流程图等,培养学生的观察能力、思维能力以及整合、运用科学信息的能力;通过联系生产实际,培养学生活学活用,理论联系实际的能力。
〖教学手段〗
CAI教学、讨论教学、对比教学。
〖教学策略和程序〗
1.教师课前准备
图片资料,科学文摘,多媒体课件。
2.学生课前准备
上网、阅览室查找资料;复习细胞工程的相关知识。
3.教学过程(见表1)
4.作业设计
(1)完成《世纪金榜》基础梳理部分,巩固课堂上所学的知识。
(2)任何新技术的诞生,总会让人们争论不休,支持者当然可以举出无数理由,反对者也能历数此项技术的种种不足,对于“克隆动物”,你是持支持还是反对态度,并分别举出你支持或反对的理由。
〖教学反思〗
1.充分体现了新课程理念
本专题内容与学生生活联系的比较少,学生对此比较陌生,因此采用了学生先复习,教师运用多媒体演示和学生活动相结合的手段,在教学过程中,合理利用图表、流程图等,培养学生的观察能力、思维能力以及整合、运用科学信息的能力。充分调动了学生学习的积极性,激发了学生学习的兴趣和求知欲,培养了学生分析问题、解决问题的能力,进一步体现了学生学习的“主体”地位和教师的引导作用。
2.教学中存在的问题
(1)对课堂的调动不够,基础好的同学思维活跃,而基础差的同学在合作学习中参与的较少。
细胞工程篇2
关键词：细胞工程；教学方法；教学改革
中图分类号：G640 文献识别码：A 文章编号：1001-828X（2016）031-000-01
细胞工程是以细胞为研究对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术[1]。是高等院校现代生物技术、生物科学及相关专业的一门重要的专业必修课，为将来学生从事生命科学相关领域的研究及产业化工作打下良好的基础。细胞工程课程内容涉及面极广，课程信息量大，国内外在本领域的研究成果日新月异，且这门课具有实践能力强，学生在学习的过程中慢慢失去了学习的兴趣。因此改革细胞工程教学方法、提高学生学习兴趣势在必行。
一、加强教材建设、适时更新教学内容
首先，根据教学的重点，选择适合的教材。教材是最重要的教学资源，是学生学习、预习、复习课程的重要工具，是良好教学质量的基础和前提条件[2]。目前，可供选择的细胞工程教材很多，我课程组选择高等教育出版社出版的李志勇主编的《细胞工程》作为教材，主要原因：1.这本教材主要以应用为主线，从优良动植物的人工繁殖、新品种培育、细胞工程生物制品、细胞疗法和组织修复4个方面全面、系统的介绍了细胞工程的理论和技术知识，涵盖了细胞工程研究的主要技术，突出了细胞工程涉及面广、信息量大的特点。2.这本教材也设计一些前沿技术、学科交叉内容，较为活泼和新颖，符合90后大学生开放性、互动性的特征。其次紧跟科学技术的发展，及时补充学科发展的前沿和发展动态。由于细胞工程技术更新快，研究成果日新月异，教材的更新速度远远落后于科技成果的更新，这就要求教师查阅大量的文献资料，搜集新技术。例如：讲授胚胎干细胞研究存在来源限制问题时，及时补充解决措施：iPS细胞可以有效的解决干细胞的来源问题，即将四种转录因子通过病毒或质粒载体导入到已经分化的体细胞中，使其核重编程而得到的类似胚胎的干细胞的一种细胞类型。iPS细胞被认为或许同胚胎干细胞一样可以作为治疗各种疾病的潜在来源问题，目前已经成为干细胞研究的热点[3]。再比如细胞核移植时，利用2015年文献《不同联合激活方式对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响》讲解细胞核移植的主要步骤，分析影响因素。通过以上案例教学，可以增加学生的信息量，开阔学生的事业，扩大学生的知识面，从而使学生掌握和了解细胞工程最新的研究进展和学科前沿。
二、改进教学方法、提高教学质量
细胞工程各个章节之间的独立性很强、技术性强，理论表述较少，步骤复杂，给学生记忆内容带来了很大的难度。再加上细胞工程实际内容基本是微观水平，比较抽象难懂。如果依旧采用传统教学的“填鸭式”授课方法，很显然学生学习兴趣不高，教学效果也可想而知。在授课的过程中，本课程组成员充分利用现代教学手段，如多媒体教学、动画、图片、视频等教学手段，使原本枯燥、抽象的内容转化成形象、可视、可听的内容，激发学生强烈的学习需要与兴趣。例如，在讲病毒疫苗生产时，正直冬季，流感高发季节，利用网上新闻视频中流感疫苗生产过程，从鸡胚的选择，到病毒的接种、收获到病毒的灭活整个过程都直观的表现出来，用时仅两分半时间，这样不仅将大量的信息和繁杂的操作细节简化，学生也很容易接受，真是起到了事半功倍的效果。再例如讲动物细胞培养时，播放小鼠脾细胞培养学生实验视频，在讲到关键环节时，教师做出提示，播放完毕后以提问的形式重点讲解，通过这种互动，学生在学习专业理论知识的同时，也学到了一些操作的技巧。除了在授课的过程中利用好多媒体之外，在授课过程中还有意识的引导学生进行研究型学习，如在讲细胞融合、转基因生物反应器时，提前从网上下载一些文章，分小组发给学生或要求学生自行下载，学生根据课本的内容自学文章，课上主要步骤讲解完毕后，以提问或讨论的形式总结文章中各个技术环节的目的，药品的作用、分析出现的问题、讨论影响技术效率的因素。这样不仅让学生积极主动的参与到相关问题的思考和探究中，激发学生学习的积极性，同事也是师生之间有了良好的交流与互动，更有益于教学质量的真正提高。
三、调整考核方式，全面进行考查
考试的宗旨是检查学生对知识和基本理论的应用能力[4]。随着细胞工程内容的不断更新、新技术、新产品的不断出现，传统的考核方式不能取得满意的效果，根据细胞工程的特点，为了检测学生对知识的掌握情况，在考试时除了保持原有的填空题、简答题的基础上，增加了实验设计题，且比例逐年能加，从开始的按照给定的图片设计，到后来的“如何设计一个方案利用1-2年的时间引种奶牛、高产tpa药物的奶羊”等，再后来的“你打算如何应用细胞工程技术去解决生产实际问题？运用所学知识设计一研究课题。（包括课题名称、研究目的、 技术方案、预期结果、进度计划、应用那些细胞培养技术）”。这些题涉及到学生感兴趣的多种技术，答案不唯一，而且学生能够合理的运用所学知识，这样比单纯考核这些技术要好很多，学生反映也很好。
四、结语
教学有法，教无定法，在细胞工程教学的各个环节，只要我们注重课程的特点，采用学生乐于接受的教学方法，才能发挥学生学习的自主性，让学生主动参与到课程中来，才能真正提高教学质量。
参考文献：
[1]李志勇.细胞工程学[M]，高等教育出版社.
[2]房耀维，刘姝，王淑军，等.提高细胞工程教学质量的几点体会[J].科技创新导报，2009（2）：130.
细胞工程篇3
关键词 动物细胞工程 教学 兴趣教学
中图分类号：G424 文献标识码：A
Interesting Teaching of Animal Cell Engineering
XU Yipeng
（Zhejiang Biometric Quarantine and Inspection and Technology Laboratory，
College of Life Sciences， China Jiliang University， Hangzhou， Zhejiang 310018）
Abstract Based on the development of modern cell biology and technology of an emerging discipline， animal cell engineering is a course that closely integrate theory and practice and that plays an important role in the curriculum of life sciences in institutions of higher learning. This article discusses how to improve the students' interest in the animal cell engineering course， in order to provide a reference for the teaching reform of the animal cell engineering course.
Key words animal cell engineering； teaching； interesting teaching
细胞工程是指按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得具有目的性状的细胞、组织、器官或者个体的综合性生物工程，是理论与实践相结合的典范，在现代生命科学的研究中，细胞工程是生物技术应用于产业一个技术公用平台，代表着现代生物工程最新的发展前沿，在医药、食品、农林等各领域发挥着越来越重要的作用，在高校生命学科及相关学科的课程设置中占有重要地位。动物细胞工程是细胞工程的重要组成部分，主要内容包括：细胞培养、细胞融合与单克隆抗体、胚胎工程、干细胞与组织工程、核移植技术与动物克隆、转基因动物与动物生物反应器和动物染色体工程等。通过学习动物细胞工程这门课程可以为学生今后从事与细胞工程有关的生物技术产业工作奠定良好的理论和技术基础。通过近两年的教学实践和改革，笔者就如何应用兴趣教学法提高学生学习效率和教学质量进行探讨。
1 合理定位课程，让学生充分认识到本课程的重要性
我校动物细胞工程这门课程是在第6个学期开设，学生已经完成对生物学导论、动物生物学、分子生物学、细胞生物学等必修课程的学习，这非常有利于学生对动物细胞工程课程中一些知识进行认知结构的迁移。而动物细胞工程在本校既然是选修课程，其教学目的也必然有别于必修课程。因此，教学目的的侧重点不再是让学生掌握一般的概念和原理，而是更多地让学生领悟和学会如何利用所学知识进行创造，让学生充分认识到动物细胞工程并非一门理论性学习为主的课程，而是一门理论和实践结合非常强的课程，是一门学好可以走向工作岗位的课程。笔者认为，在教授此课程时，需紧紧围绕细胞水平的技术创新和技术应用为中心，联系现代生物技术产业，使学生了解动物细胞工程各主要技术领域的原理和方法及其应用。
2 上好第一节课，吸引学生眼球
上好第一节课，也就为本课程的整个教学过程定下了基调。第一节课的内容无非是绪论部分，大多老师可能会对本课程的发展、地位等娓娓道来，但是却不能引起学生的兴趣，笔者尝试提问式教学代替讲述式教学收到了良好的效果。比如在讲述动物细胞工程的研究领域时，笔者就在教学PPT中列出“多莉”羊、 “人耳鼠”、“试管婴儿”、发光猫等图片尝试让学生对位入座，以激起学生的兴趣。
3 紧跟时代步伐，更新教学内容
目前细胞工程相关的教材有安利国版《细胞工程》（科学出版社）、杨吉成版《细胞工程》（化学工业出版社）、李志勇版《细胞工程》（高等教育出版社）、庞俊兰版《细胞工程》、叙永华版《动物细胞工程》等，笔者所用的参考教材是安利国版《细胞工程》。虽然相关教材众多，但生物技术发展日新月异，教材的更新速度根本无法赶上，因此，必须及时查阅相关文献或信息，传授学生最新的知识。比如讲解胚胎工程可引入人类早期胚胎的成功培养；讲到转基因动物可引入中南大学的“供体猪”；讲到干细胞可以引入“人工肾”等。
4 以社会问题或社会需求为切入点传授理论知识
单纯理论的讲课效果，或者先理论讲解再到实际应用讲解的效果其实并不如从实际需求到理论讲解的效果好，因此笔者在讲解每个章节时尽量先引入社会问题或社会需求再来讲解理论知识，这样一来，学生课上的专注度明显提高，收到的讲课效果也非常好！比如在讲解细胞融合与单克隆抗体这章时，笔者就抛出杭州下沙企业期望与浙江高校合作解决的一些项目，其中就有不少抗体制备技术，这即刻引起学生的关注；比如在讲解干细胞这章节时，引入 “儿子严重烧伤 父亲拒用麻药割皮救子”的新闻事件，让学生重视干细胞研究的重要性；在讲解胚胎工程时，引入广州“代孕事件”。
5 合理利用多媒体技术
动物细胞工程是一门综合性很高的课程，传统的“粉笔+板书（或PPT）”的方式已经难以满足新形势下对这门课程教学的要求。现代教育技术在高等院校中已得到普及应用，通过多媒体技术，我们可以给学生展示除课本外更多的图片和视频信息，甚至可以直接在上课时在网上搜索相关信息给学生看。这些多媒体技术的应用在提高学生学习兴趣的同时，可以发散学生思维，不但可以补充书本内容，也可以提高学生对书本内容的学习效果。比如在讲解实验室的安全性时，可引入电影《生化危机》片段；在讲解细胞融合时，可引入《杂交》这部电影；在讲解胚胎工程时，可辅以3D动画演示婴儿从受孕到诞生全过程；讲干细胞可引入“八戒的肝救活孙猴子”的新闻。每次课讲授时适当适量适时地引入一些多媒体图片、视频或动画信息，可以在上课之初即刻吊起学生对即将要学的知识的胃口，也可以在课中学生注意力不集中时再次把他们的注意力拉回来，多媒体图片或视频可以说是调动学生学习兴趣的一把利剑。但是这把利剑不能过度应用，否则就主次不分，学生把握不住重点，效果就会适得其反。
6 在讨论中实践实验
笔者所授的动物细胞工程有8个学时实验，实验内容为细胞培养的基本过程，基本为验证性实验，但这并不妨碍学生对知识的学习，这主要在于讨论式学习的引入。实验课之前，笔者在课堂上放映培养基过滤操作视频、细胞原代培养操作视频、小鼠心肌细胞培养操作视频等，让学生思考视频中实验人员的操作规范问题，让学生知道实验操作中的注意事项及其对实验结果的影响。在实验课中，引导学生对比实验前后结果，得出自己的结论，比如在做细胞培养基过滤实验时，教学生用倒置显微镜观察未过滤培养基的受污染情况，判断污染微生物的类型，从而让他们知道正确过滤的重要性以及如何处理受污染的培养基。
细胞工程篇4
【摘要】 目的 制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用三硝基甲苯和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达，扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。
【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性
【Abstract】 Objective To produce the acellular muscle as biomaterial scaffold and to observe its biocompatibility with the human amniotic epithelial cell. Methods The acellular muscle scaffolds were made by extraction with 3% Triton X100 and 1% sodium dodecyl sulfate. The histological structure of acellular muscle was observed in frozen section. Then the cultured human amniotic cells were implanted into acellular muscle scaffolds. After cultured 1 w， the scaffolds with cells were sectioned， and BrdU，NT3 and BDNF immunohistochemical staining were performed to observe the proliferating capacity and the expressions of NT3 and BDNF of amniotic cells in scaffold. SEM was performed to examine the distribution of human amniotic epithelial cells growing in scaffold. Results The cells in scaffold completely disappeared after the muscle had been extracted. The scaffold of acellular muscle was arranged in parallel tubules composed of collagen fibers and elastic fibers which were left intact. In scaffold the human amnion cells could proliferate and synthesize NT3 and BDNF. Scanning electron microscopy demonstrated a uniform distribution of cells in scaffold. Conclusions The cells in rat skeletal muscle are successfully removed by chemical extraction. The acellular muscle scaffold made in this way possess good compatibility with human amniotic cells.
【Key words】 Acellular muscle; Human amniotic cell; Biocompatibility
近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处，4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3，脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后，转入3%的TritonX100溶液，摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。
1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。
1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。
1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定
1.2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。
1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
2 结 果
2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色，半透明，质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失，而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。
2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图
图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色
图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。
3 讨 论
理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似，仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。
由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括胰岛素样生长因子、层黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质，IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。
总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。
参考文献
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10 李培建，胥少汀.去细胞肌肉支架移植及神经生长因子对脊髓横断性损伤的修复作用〔J〕.中国脊柱脊髓杂志，2000;10(4)：2203.
11 Fansa H，Keilhoff G.Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects〔J〕. Neurol Res，2004;26(2):16773.
细胞工程篇5
关键词：细胞工程；教学改革；教学方法
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）02-0146-02
细胞工程作为现代生物技术的桥梁和纽带，与基因工程、蛋白质工程、代谢工程、生物制药、组织工程等密切相连，因此细胞工程是生命科学本科教育中生物技术专业的一门重要课程。该课程是实践性和综合性很强的学科，是发展最为迅速的学科之一，知识更新周期短，技术创新速度快。在教学过程中既考虑到课程内容的基础性，又考虑到内容发展的前沿性，即在教学过中注意将最新资料渗透到教学中，帮助学生加深对学科知识的理解，掌握实验技术的要领，培养学生的创新意识和创新能力。为了适应当今高等教育的发展，培养高素质的专业人才，尤其是近年来由于大学生就业遭遇瓶颈，考研率高，造成了高年级学生心态不齐和浮躁情绪，逃课现象屡禁不止的情况下，在大学高年级学生的专业课教学中进行教学改革，有十分重要的现实意义。我们针对我校细胞工程教学和实践的实际情况，从教学和实践的内容、教学手段、教学方法等方面进行改革探讨，收到了较好的效果。
一、明确课程定位，坚持“以学生为本”的教育
任课教师必须通过认真学习生物技术专业本科生培养方案和课程大纲、请教老教师教学经验及调查学生情况，对细胞工程课程进行正确定位，明确该课程在学生的知识体系中起到什么作用，根据生物技术专业培养方案和课程大纲要求，了解该课程要教授学生什么样的知识，同时在21世纪这个崭新的时代，我们的学生想学习什么样的知识。在进行课程改革时，坚持“以学生为本”指导思想，整合优质教学资源，既要从学科发展的角度考虑问题，也要从学生的角度换位思考，从而使教师传授给学生的知识和学生真正需要的知识有机结合，实现我们所期望的优质教学的目的。
二、运用多种教学方法，提高教学效果
多年的应试教育使大多数学生已经习惯于被动地接受知识，独立思考及自主学习能力较差，培养其主动学习、创造性思维能力是一个循序渐进的过程，需要较长时间和多学科的共同努力。为培养学生主动学习的习惯，我们首先通过多种手段，将细胞工程涉及的微观水平上，看不见、摸不着的，尤其是技术操作过程，利用现代化教学手段――多媒体，将技术以图示、图像、动画和视频等多种形式显示，使学生直观、形象地理解教学内容，激发学生的学习兴趣。同时采用双主体互动教学模式，双主体即教师与学生，他们同处于主体地位。两个主体间的互动效果，对学生学习的积极性有明显的影响。如何通过互动提高教学效果？若小班教学，即学生不超过60人，可采用分组选择课题的方法[1]，即采取自由结合的形式，每组4～6人，可根据细胞工程学教材中所包含的内容进行选题，并对所选题目进行评议，最后确定每组所演讲的专题。实行组长负责制，组员介绍、内容安排、讲述顺序安排及总结性发言均由组长负责。这部分内容由学生主要参与，既能对课程形成有效的互补，同时也能增加学生的学习积极性，让学生知道如果了解新的研究进展，对其以后的科研道路会有很大的帮助。当然这也要求任课教师要及时、积极地学习和储备该课程相关的进展知识。但若该专业学生人数大于60人，仍采用该方法，每组人数必然增多，当每组人数大于8人，则必然达影响我们预期的效果。此时采用启发式或讨论式教学，更为有效。启发式教学要求教师在备课时，准备启发式问题，若设计的问题能够一环扣一环，以问题驱动学生的学习需求，激发学生的求知欲望，则达到教学目的；而讨论式教学，则要求任课教师针对某一章节的知识点、进展和争议设计几个问题，让学生分组随堂讨论，回答问题，这种随堂讨论及时获得答案的方法，即使人数较多，学生也会比较积极参与。但这些方法都对我们的任课教师有较高的要求。
三、融合科技发展，更新教学内容
当今世界科学技术突飞猛进，知识信息量迅速增长，科学知识更新淘汰速度加快，这就要求任课老师及时更新自己的知识结构，跳出书本，站在现代科技发展的前沿，掌握生物技术领域科技发展的最新动态，及时地把这些动态的新的研究成果以及有待攻关的重大课题融入教学内容，引导并激发学生探索新知识的兴趣，开阔视野，增长知识，帮助学生学会预测和构想未来事物的发展变化，不断增强学生学习的自觉性和创造性[2-3]。
任课教师在厘顺教学体系的基础上，查阅各类中外文期刊，根据近年来该领域的发展动态，力求把该领域的最新科研成果和亟待解决的关键问题融化到教学内容中。譬如讲解“干细胞”时，及时把最新成果传播给学生：2007年，日本籍科学家山中伸弥所在的研究团队通过对小鼠的实验，发现诱导人体表皮细胞使之具有胚胎干细胞活动特征的方法。此方法诱导出的干细胞可转变为心脏和神经细胞，为研究治疗多种心血管绝症提供了巨大助力。这一研究成果在全世界被广泛应用，因为其免除了使用人体胚胎提取干细胞的伦理道德制约，凭借此研究成果山中伸弥获得2009年拉斯克基础医学奖和2012年诺贝尔医学和生理学奖。再如讲解“克隆技术”时，除了介绍常规的克隆技术新成果，2004年中国首例异体克隆动物“北山羊”在新疆降生；2007年9月14日中国完成世界首例转基因克隆兔实验，实验兔含有外源的绿色荧光蛋白基因之外，我们还可以将2008年英国科学家通过“三亲胚胎”技术培育出了新型人类胚胎，进行线粒体疾病治疗[4]的知识介绍给学生。教师在获取这些信息的当时就将其作为相关技术的补充内容向学生传授，使学生了解该研究的最新动态。我们发现把最新成果融入到教学内容中，是引发学生学习的最好动力。因此，要求教师对讲稿进行及时更新，及时查漏补缺，决不用陈旧的、过时的资料，这样，既对学生负责，同时也提高了自身的水平。
四、进行系列设计实验，改进实验方法
细胞工程是一门实践性非常强的学科，没有实际的操作，无法使学生对所学的知识有一个深刻的认识，所以细胞工程的实验环节对学生的学习和知识的构建尤为重要。细胞工程实验涉及内容及相互独立又相互关联，将实验内容设计得环环相扣，既节省材料，降低实验费用，又节省学时，为学生提供更多的实验机会。李艳红[5]也曾采用系列设计实验，取得较好的教学效果。我们采用系列设计实验，即前一个实验是后一个实验的基础，这样从经典的基础实验到难度较大的实验，一环紧扣一环，将所学的知识连成一个整体。具体到我系，实验从培养基的配制、愈伤组织的诱导和再生到原生质体的游离和体细胞杂交。其中体细胞杂交即细胞融合，是细胞工程课程中很重要的章节和实验内容。但该实验历时较长，尤其是材料游离，往往需要过夜，而且采用国产酶游离效果差，进口酶又价格昂贵，分离纯化的过程，学生也不容易操作。怎样才能缩短材料的游离时间，降低费用，同时又能达到良好的教学效果呢？通过我们的实验验证，采用细胞间隙较大的薄壁组织作为游离原生质体的材料，比如状态良好的愈伤组织或者某些幼嫩的茎段，甚至是芦荟也可以，这样酶液较易进入组织内部，游离的时间就会大幅缩短，因为游离时间短，采用国产酶不会对材料产生较大的伤害，所以可以降低实验成本。游离纯化的操作可将20%左右的蔗糖换成23%pecell溶液，提高纯化效果。对于那些限于学校条件无法开展的实验，则积极想办法让学生到校外公司或企业参观学习，以提高他们的学习兴趣。
通过研究与探索细胞工程课程教学体系，我们对该课程进行正确定位，采用灵活多样的教学方法和现代化教学手段，把最新的科技发展成果融入到教学内容中，提高教学内容先进性和科学性。细胞工程课程教学改革虽取得了一些成绩，但还存在不少问题。比如细胞工程教材，就目前而言，绝大多数教材介绍基本常规技术较多，涉及理论和进展较少。技术课程要有相应的理论支撑，细胞工程技术也是这样。本科教育不应该只是教给学生每种技术的操作规程，而是在学生掌握基础知识、掌握技术的同时，融入进展并提出问题。如细胞操作之后，存在的各种可能变化、这些变化给我们带来了哪些思考、哪些问题我们已经知道了答案、哪些问题还存在争议、还有哪些等待解决？提出了问题才能让学生对其产生浓厚兴趣。所以今后，我们将不断通过学习掌握新的知识、提高自身的理论认知水平，为学生提供更好的教材，同时每次上课前精心备课，点燃学生对知识追求的火种，并在教学实践中对课程教学体系不断改进，进一步提高细胞工程教学质量。
参考文献：
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[2]陈祥，潘志明，耿士忠，等.新时期细胞工程教学改革与实践[J].现代农业科技，2008，（12）：329-331.
[3]胡尚连，孙短，曹颖.植物细胞工程理论与实践教学体系探索与实践[J].中国校外教育，2008，（2）：136-137.
细胞工程篇6
关键词动物细胞工程;开放实验教学;教学模式;西南科技大学
abstractthe opening experiment teaching mode in animal cell engineering experiment of bioengineering specialty was discussed in this paper. five teaching links such as experiment project design,project discussion,experiment operation,experiment report andexperiment summary were actualized. the teaching effect was turned out fine. while,existing problems and improvement measures about this teaching mode were pointed out to provide reference for better opening experiment teaching.
key wordsanimal cell engineering;opening experiment teaching;teaching mode;southwest university of science and technology
西南科技大学地处四川省绵阳市,是中国西部的一所重点建设学校。WWw.133229.COM西南科技大学生命科学与工程学院现共有7个专业,其中包括生物工程专业。由于生物工程专业是一门实验性、实践性非常强的学科,对该专业人才培养的要求是要具有较深厚的理论基础和较宽广的知识面,较强的实验、实践能力和创造能力。因此,笔者在优化理论教学的同时,也在积极思考如何加强生物工程专业的实验教学,强化实验与实践能力的训练,培养学生的动手能力,激励学生学习兴趣和创新精神,提高学生综合素质。传统的生物科学专业实验项目大多属于单一的验证性实验,且内容多是依附于各门课程的理论授课而开设,实验方法刻板,学生上实验只是被动应付、机械操作。这种“照方抓药”的实验形式极不利于学生智力的开发,限制了创造性思维的发展,不能充分调动学生的积极性和能动性。因此,生物工程专业的实验体系改革势在必行。近年来,西南科技大学加大了对本科教育的实验建设投入,大大改善了本科生实验条件。2010年,生命学院抓住学校迎接本科教学水平评估的契机,根据实际情况,申报了一个实验室建设项目“生物工程实验室建设”,得到了学校的批准并立项。在项目的实施过程中,不仅考虑了实验室软、硬条件的改善,同时也把实验教学模式的改革放到了重要的位置[1-2]。
1课程简介
《生物工程大实验》是生物工程专业的一门必修实验课,主要包括发酵工艺学、植物细胞工程、动物细胞工程3部分,在课程的教学过程中,动物细胞工程的实验周期相对稍短一些,同学们对动物细胞工程兴趣会更浓一些,因此,在动物细胞工程实验教学上应率先进行开放教学模式摸索。
2教学形式
教学共分为5部分内容,包括实验方案设计、方案讨论、实验操作、实验论文报告、实验总结。
2.1实验方案设计
笔者在进行《动物细胞工程》理论教学中,发现学生对动物细胞培养特别感兴趣。利用学生的这种好奇心理,在课程结束时,安排学生做了一个实验方案设计——小鼠××细胞系的建立,该设计既是理论课程的一个结课报告,也是本实验的一个实验指导。为节省材料,将学生分成几个大组,每个大组8个人,然后每个大组再分成4个小组,每小组2个人。每个大组发放1只小白鼠,每个小组的学生根据自己的兴趣,可自由选择目的细胞,包括肌肉细胞、肾脏细胞、肝脏细胞、肺细胞、骨髓干细胞等。这样在一个大组内就可做不同的细胞,便于同学之间的相互交流和学习,同时也节约了材料。
该次实验方案是一个完整的有关动物细胞系建立的具体方案,包括实验准备工作、培养基的配制、原代细胞培养、细胞的纯化与传代、细胞生长曲线的测定、细胞的冻存与复苏。在方案中,要求学生详细写出实验目的、实验原理、实验材料、方法与过程及注意事项,这就要求学生认真思考自己所需要的材料,因为每组学生所做的细胞不同,采用的培养及纯化方法也不相同,所需要的材料也不相同,包括需要哪些药品、试剂怎样配制、需要多少吸管,甚至连废液缸都要考虑到。这样培养了学生的主动思考能力和积极参与性,而不再像以前一样由老师准备好所有器材,自己只需要按照老师指定的步骤,将老师已准备好的试剂一一的加进去即可。
2.2方案讨论
方案设计好以后,教师进行修改,主要指出一些原则上的错误,让学生进行改进,然后进行交流。挑选一个比较典型的小组,向大家汇报,让同学来指出其设计上的不足,再在老师的指点下,比较自己的方案,这样在讨论中让学生对自己的目的和要求更加清晰。最后,给大家播放有关动物细胞培养方面的教学录像,详细介绍在操作中的注意事项,特别是一些细节问题,让同学们事先有所了解。
2.3实验操作
大家的方案在讨论和看完录像后再一次进行修改,经老师修订同意后就可进行实验操作环节。学生按大组领用所需的器材,自己进行清洗、包装和灭菌处理,配制所需的试剂,按照设计的实验方案进行实验操作。在实验过程中,由于细胞生长的进度不同,同学们需要在不同的时间来进行处理。为解决这个矛盾,实验室采取了全天开放、学生预约登记的形式,保证学生可以在预定的时间进行实验。在实验进行过程中,要求学生每天来观察细胞生长情况。
2.4实验论文报告
该实验报告采用科技论文报告的形式代替传统的实验报告,要求学生严格按照科技论文格式写出题目、前言、材料与方法、结果与分析、讨论与建议。前言部分要求学生简单介绍实验的原理与目的,由于动物细胞原代培养与细胞纯化的方法很多,多种方法大多可以使用,学生甚至可以同时使用不同的实验方法进行,但要求必须写出选择此方法的依据。材料与方法部分要尽可能详细,以锻炼学生自己动手准备实验的能力。实验结果要实事求是地记录下来。讨论为重点部分,要求结合理论知识对实验结果进行分析、综合、归纳和推理。若结果与预期不符,应分析原因,列出改进措施。最后,要求学生对此次实验教学提出自己的看法和意见。
2.5实验总结
课程结束后要对此次实验的情况进行总结,对出现的一些典型的情况进行分析。比如染菌严重等。分析其可能的染菌环节,及操作上的一些不正确的地方,让学生明白自己的不足之处。
3教学效果
此次开放实验教学,总体来说还是取得了较为满意的效果,与以前传统的实验教学方式相比,该教学主要达到了以下目的[3-4]:
3.1真正做到了理论和实践相结合
由于《动物细胞工程》是一门理论与实践结合非常紧密的课程,在课程讲授过程中,会涉及到许多与实验操作有关的知识,而学生以前并没有相关知识的积累,讲解起来非常空洞。比如,在讲授原代细胞的制备方法中,会包括酶消化法和组织块法2种方法,这2种方法有何优缺点,应怎样根据实际情况进行选用等,这类知识教师通常在课堂讲授时只讲一些基本的理论知识,而具体情况需同学们通过自己的实践和相互交流就得到深刻的认识。
另外,由于要求学生自己动手设计实验方案,而方案的设计必须建立在踏实的理论知识基础上,这就要求学生在实验方案设计的同时,必须理清楚方案设计的理论依据,同时也培养了同学们查阅资料、阅读文献的能力。
3.2有效培养了学生的动手能力、思维能力,训练了从事科研工作的基本功
由于实验带教老师仅指出实验的名称,提供与本实验相关的实验器材、试剂、动物等,其余由学生通过阅读教材、查阅资料,明确实验目的、实验方法与步骤、注意事项等内容,并在此基础上按步骤进行操作。在教学过程中,学生始终处于主体位置,教师则处于主导位置。学生在实验中必须充分应用所学的理论和已掌握的技能,完成整个实验,包括实验的设计、操作的步骤、仪器和材料的选择、结果的分析等。其中每一步骤对学生来说都是全新的,充满了挑战性,试验结果不是预先知道的,学生必须对实验中出现的异常现象及时分析,并提出相应解决办法,这就要求学生要有严密的实验思路和严谨的科学态度,调动学生的主动性。比如器材的清洗、包装、灭菌等工作,平时大家都不太重视,而通过实验,就有了切身体会,有的同学在做过滤除菌制备培养基时,由于无菌工作未作好,导致培养基染菌变浑浊而只能重做。由于各小组的实验材料和结果都不相同,也进一步拓宽了学生的知识面,充分挖掘了学生的创造才能,促进学生科学素质的提高,培养学生的综合能力。
实验结束后要求学生按照论文的格式和规范撰写实验报告。对于普通高校的大多数学生来说,撰写论文是一件遥不可及的事情,现在他们具有了论文的素材,就可以模仿科技论文的写作要求去完成,使学生获得了撰写科研论文的训练,掌握了从事科研工作的基本功。
3.3加强了老师和学生之间的交流,增进了师生感情
由于学生频繁出入实验室,与老师接触的时间增多,师生之间可广泛的进行交流,可以加深学生对老师的理解、对教师行业的尊重。
3.4培养了责任心和科学态度,提高了兴趣,增强了自信心
实验分小组,做到任务到人,每个人对自己培养的细胞都爱护有加,这种负责任的心态是在做别的实验时看不到的。与以往实验不同,同学之间是用自己的劳动成果做比较,都格外努力。成功的同学根据自己的想法做设计、做实验,获到了很好的结果,会产生一种自豪感和自信心。而失败的同学虽然有一些丧气,但在认真总结教训和向成功同学取经的基础上,在第2次实验中还是会得到满意的结果。另外,由于实验过程中需要同学之间相互合作、协调进行,增进了同学的团结、互助、协调的精神。
3.5提高了师资队伍水平和实验教学质量
开放式教学中一些实验内容反映了当代科学技术的发展水平,涉及的知识面广。教师不仅要有本学科扎实的理论基础、较好的实验技能,还要加强业务学习,不断更新自己的知识,这在新实验开设和学生科技创新活动中显得尤其重要。可以说开放教学提高了师资队伍业务水平。从传统的实验教学到开放性实验教学的转变不仅对教学双方产生巨大影响,对提高实验室的建设和管理水平也会起到不可估量的作用,这种改革无疑会使实验室的各项工作发生质的飞跃。开放实验维护了学生的原创精神,能使学生在宽松的实验环境中实现从被动学习到主动学习的转变。可以说开放实验是实验教学中实现因材施教的必由之路,是培养学生创新能力的必备条件。
4存在的问题与改进措施
4.1实验室配套设施不完善
由于实验人数剧增、延续时间较长,仪器设备接待能力明显不足。因为细胞培养严格要求无菌操作,所以,大部分操作都在超净台上进行,这样就造成对超净台需求的矛盾。而且,因为同学们大多是新手,操作时非常小心、谨慎,这样也常常导致不能按照预定的时间结束实验,设备流动速度慢,同学们等待时间较长。另外,由于学生人数多,人流量大,导致无菌室有名无实,也由此使一些同学的实验材料被污染。
4.2增加了教师的实际工作量
设计性实验教学比单项实验教学工作量大、持续时间长。为了充分利用设备,缓解实验室设备紧张的压力,在一个规定的时间段,采用了学生预约、全天开放的实验模式。为了做好实验,同学们无论中午、晚上,只要有时间就可以到实验室做实验,由于学生以前没有受过这样的训练,教师必须随时在场给学生提供帮助,这就要求教师做出更多的奉献。另外,由于学生采用了各种各样的材料,教课老师需要查阅大量的资料,自己做一些预备实验,这样才能更好地指导学生。
4.3加大了实验费用开支
实验要求学生自己准备实验材料和试剂,这比教师统一准备要消耗更多的实验试剂和材料,从而加大了实验费用开支。而且由于大家所采用的实验材料不一致,虽然老师在审阅设计方案时,取消了一些耗费较大的项目,但是仍然需要准备各种实验相关试剂和材料,也造成了实验开支的大大增加。
5结语
与课堂理论教学相比,实验教学更有利于培养学生的创新能力,实验室是让学生学会从实践中发现问题、解决问题和将所学知识运用到实际中去的重要场所,是培养具有创新能力的科学研究和应用人才的实践基地。而要真正上好实验课并非易事,综合性、设计性实验教学仍有待进一步完善。
6参考文献
[1] 常东胜,李涛,李静平.开放式实验教学模式的探讨[j].齐齐哈尔医学院学报,2005,26(7):810-811.
[2] 李江滨,黄迪南,侯敢.生物化学实验教学改革探讨—— 论文式实验报告[j].卫生职业教育,2005,23(15):100-101.
细胞工程篇7
关键词:动物细胞工程;实验教学;教学改革
1加强安全意识培养
动物细胞工程实验主要在生物工程、生物技术专业开设。上述2个专业学生来自全国不同省份，各地中学生物学实验条件不同，学生实验水平参差不齐。此外，动物细胞工程实验中，会涉及病毒等微生物的实验操作，因此在学生进行实践操作前设置了“安全教育、规范化操作、仪器的使用”这一准备教学环节。学生通过观看教师录制的视频资料，学习相关实验操作后，必须在线进行实验安全知识考核，测试通过后方能进入实验室进行动物细胞工程课程操作。如不合格，必须重新学习，直到考核通过，方可进入实验室进行操作。
2优化实验课内容
教学改革之前，动物细胞工程实验课主要包括细胞原代培养、传代、冻存等实验操作。虽然能涉及动物细胞操作内容，但系统性不强，与企业实际需求对接性差。因此，课程组成员对省内高校及生物医药企业进行调研，重新修订教学内容。根据企业生产岗位技能要求，编撰动物细胞工程实验课程工作手册。该手册下设若干工作项目，每个项目又包含任务书、准备单、工作流程、注意事项等内容。通过项目化教学使学生明确任务目标、了解工作流程。课程内容以吉林正业生物制品有限公司鸡新城疫疫苗生产岗位要求为基础，优化整合实验项目。改革中，删除鸡红细胞制备及融合这一实用性较差的实验项目，设置鸡胚成纤维细胞(CEF)培养的准备工作，鸡胚成纤维细胞的原代培养，鸡胚成纤维细胞培养过程的传代培养、培养过程的检测与观察，鸡胚成纤维细胞对鸡新城疫病毒(NDV)的培养，鸡新城疫病毒的鉴定，鸡胚成纤维细胞的冻存与复苏及非洲绿猴肾细胞(VERO)的复苏与传代(拓展性实验)。
3改进教学方式
3.1项目化教学
在以往的实验教学中，通常采取学生课前预习、教师课上讲解、现场演示、学生完成实验相结合的教学模式，往往不能获得好的教学效果。本课程改革针对上述问题，围绕教学目标，以激发学生兴趣、培养学生团队精神为主线，教学方式做出如下改进:授课教师下发项目任务书，解析任务目标;学生自主成立团队，根据任务要求，通过查阅资料、讨论来设计实验方案，授课教师指导并完善实验方案;各团队以教师指导为基础，在团队负责人组织下，进行工作;完成任务报告单，组内进行汇报交流;实践技能考核;课程实践教学全部结束，以团队为单位，开展实践教学收获与心得汇报。
3.2多媒体教学
多媒体教学具有文字、图像、视频、音频等相结合的特点［2］。但在以往实验教学中，大多仅使用PPT中“图片演示”功能，忽视视频教学的应用［3］。因此，在本次教学改革中，将视频教学作为动物细胞工程实验教学的重要补充手段。课程组成员录制实验操作视频，使学生能对实验项目直观化。同时，课程组购买大量实验教学光盘，便于学生拓展知识面。
3.3虚拟仿真软件辅助教学
仿真教学又称模拟教学，是利用计算机软件模拟真实自然现象或社会现象，学生通过计算机软件扮演某一角色，从而进行技能训练的一种教学方法。虚拟仿真教学可在很大程度上补充客观条件的不足，能为学生提供近似真实的实验环境，从而提高学生职业及实践技能［4］。基于此，吉林农业科技学院在考察各兄弟院校虚拟仿真教学软件基础上，购买了莱医特虚拟仿真软件。在实验项目过程中，学生在观看课程组录制的实验操作视频后，可以在学院机房仿真软件上进行“预实验”，即通过软件进行原代细胞分离、换液、传代、冻存、复苏等基本细胞操作。通过仿真软件的“预实验”使学生能在头脑中对细胞操作有更直观的认识，同时，通过教学软件的考核，可以使学生初步了解细胞操作的注意事项，总体提高学生的实验操作技能，提升教学效果。
4改革考试方式
客观公正、真实有效的实验考核体系，不仅能提高学生对实验的重视程度，也能调动学生对知识探索的积极性，增加学习兴趣，督促和引导学生日常学习情况和态度，从而提高实验教学的效果［5］。因此，课程组制定了适合该门课程的考核方式。包括技能考核、小组讨论、心得汇报、组员汇评、本人自评、实验效果、教师评价、奖励分值上述8项内容，其中技能考核、实验效果、教师评价各占20分，其余4项各占10分(以百分制计算)。通过考核方式的改革，使学生重视课前预习、课上实践操作、课后讨论，提高了学生的实验操作技能，促进了学生处理问题解决问题的能力，加强了学生的团队合作意识，使学生更加能适应日后的工作需求。将一部分实验内容交给学生自主设计，仅向学生讲授实验目的和原理，实验操作部分由学生独立完成。在实验教学中，教师仅发挥引导作用，试剂配制与器皿的灭菌等具体操作均由学生独立完成。通过上述措施提升学生的动手能力，极大促进了学生创新创业素质的培养。学生们能够自主申报挑战杯项目、各级大学生创新项目与创新创业项目，各级生命科学竞赛等;能独立完成项目和毕业论文;还可承担教师的一部分研究工作，提升了自身的科研能力和创新能力。
5存在不足与改进措施
5.1实验室配套设施不完善
学院细胞间实验室内的超净工作台数量不足，实验进行时，每位同学都需要动手操作，不能满足有限学时内的教学任务。导致学生频繁进出细胞间，实验材料出现污染情况。此外，在细胞冻存环节中，多组教师同时进行实验时，细胞冻存盒数量无法满足实验需求，只能用程序降温法。这不但增加了教师及部分学生的工作时间，细胞冻存效果也受到影响。因此，吉林农业科技学院计划今后增加细胞间面积与超净工作台等配套设施数量，提高实验课程效率。
细胞工程篇8
关键词：心肌组织工程； 种子细胞。
组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。其核心是模拟体内组织发生的环境，在体外培养细胞，构建由细胞和生物材料组成的、具有特定功能的三维工程化组织。组织工程心肌主要涉及种子细胞来源，支架以及体外构建方式和移植。下面我们主要讨论重点是心肌组织工程种子细胞。
1心肌组织工程的细胞来源
构建工程化心肌组织的最佳细胞，应该是容易获得的、能增殖的、无免疫原性的、具有分化为成熟的有功能的心肌细胞的能力的细胞。遗憾的是，目前还没有发现这样的细胞。供体(异源的)细胞相对容易获得，但是具有免疫排斥反应的风险；而自体细胞虽然很难获得和扩增，但是没有免疫排斥的困扰。目前，已报道的应用于心肌组织构建的细胞包括胎儿心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼成肌细胞、天然骨髓细胞、间充质千细胞和胚胎干细胞等。
1.1心肌细胞胎儿心肌细胞是研究的最早最广泛，被认为是目前干细胞研究领域的一个重要方面。Soonpa等［1］最早将胎儿心肌细胞移植到鼠的心肌。Scorsin等［2］将胎儿心肌细胞注射到心肌梗死模型鼠的左心室心肌，研究表明有50％的鼠的梗死边缘区有被注射的心肌细胞。胎儿心肌细胞移植能改善左心室功能，提高射血分数和心输出量。但胎儿心肌细胞作为种子细胞受到至少两个方面的限制：一是胎儿心肌细胞的来源，包括由于胎儿心肌细胞来源带来的伦理和法律问题；二是作为一种异体细胞移植而带来的免疫排斥问题。
1.2天然骨髓单核细胞天然骨髓单核细胞与其他细胞相比，这种细胞具有易获得、自体的和易扩增的优点。应用受限是由于它们很难转分化为心肌细胞或内皮细胞。
1.3骨骼肌成肌细胞骨骼肌成肌细胞不太可能成为心肌组织工程种子的原因是其分化后很难与宿主心肌发生电机械偶联。
1.4骨髓间充质干细胞干细胞被视为一种好的组织工程心肌种子细胞来源，是因为它们可再生能力强，高增殖能力和多能性。干细胞具有可以在一定条件下分化成心肌细胞的能力。因此多种心肌组织工程方法都是基于干细胞的运用。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下，能分化为成骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、内皮细胞，神经细胞和心肌细胞等。大量研究表明人骨髓间充质干细胞在适宜条件下也可向心肌细胞分化，除此之外，它还能分化成血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等，对心肌细胞起着重要的支持作用［3］。Rangappa等［4］应用人骨髓间充质干细胞和人心肌细胞在体外共培养，结果表明人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，有收缩蛋白和心肌特异基因的表达。Xu等［5］成功地进行了成人骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌细胞的诱导分化。苑媛等［6］报道，血管紧张素Ⅱ在体外可能经细胞外信号调节激酶通路诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。动物实验显示，对实验动物的心脏梗死区移植经5一氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞，1个月后，骨髓间充质干细胞能在心肌梗死后心力衰竭的心肌及疤痕中存活并向心肌细胞分化，且改善受体的心功能［7］。骨髓间充质干细胞具有以下特点：（1）来源于自体，无免疫源性；（2）取材损伤小，仅行骨髓穿刺就可获得；（3）来源充足，可反复取材；（4）扩张能力强；（5）培养要求低。因此，骨髓间充质干细胞是心肌组织工程中前景广阔的细胞来源。
1.5胚胎干细胞胚胎干细胞有和骨髓间充质干细胞很类似：胚胎干细胞的来源不受限制，具有无限扩张能力，而且已证实了具有心肌分化潜能。但它来源于异体，但是目前研究发现，胚胎干细胞及其子代细胞具有免疫源性，另外人类胚胎干细胞的移植还涉及伦理方面的问题。申请临床应用受阻的主要原因也是人们对于同种异体来源导致潜在致癌性的担虑。
1.6诱导多能干细胞最近的一个克服上述问题的方法是将不成熟的基因（如卵母细胞）整合在成熟自体的干细胞。这种全新的概念叫做核移植，并且可以产生自体多能干细胞系。这种细胞被称为“诱导多能干细胞（iPS）”。Mitalipov’s group报道已经成功通过核移植的方法改编哺乳动物的成体上皮细胞，得到了多能干细胞［5］。就在同时，京都的研究人员将带有4种确定转录因子(Oct3/4,Sox2,Klf4,and c-Myc)的人皮肤成纤维细胞转导产生了一个多能干细胞系［8］。这些细胞表达人ESC的表面标志，具有正常的核型，并且表达端粒酶，满足多能性的标准。核移植也许对将来的心肌组织工程具有相当重要的意义。比如在组织工程化组织窦房结，组织工程化心肌等方面，能制造出理想的种子细胞。
1.7心脏自身干细胞由于免疫方面的顾虑阻碍了做关于人类心脏组织工程的研究。最近发现人类固有的心脏自身干细胞能够分化成有有功能的心肌，这无疑给人类心肌组织工程带来了新的希望。人类心脏一直被认为是终末分化的器官。10年前，研究人员在成年大鼠心脏里面发现存在固有心肌干细胞［9-12］。最近在人类心脏中也发现了类似的干细胞［13-15］。将其和正常心肌细胞混合培养后，注射到心梗区域，这些细胞能够产生新的心肌组织并且修复心脏的功能。现在已经找到该细胞的数种细胞表面标志物，比如c-kit,sca-1,isl-1，以及ABC载体（Abcg2）。但都还缺乏特异性，要如何准确筛选该细胞依旧还是没有解决的问题。
2总结
构建工程化心肌组织的最佳种子细胞，必须是能够容易获得的、能增殖的、无免疫原性的、具有分化为成熟的有功能的心肌细胞的能力的细胞。遗憾的是，目前还没有发现兼具这样优点的细胞。制造或再生心肌组织去替换或是修复因损伤、衰老、疾病或基因变异而丧失功能的心肌组织目前大量研究表明是可行的。但是，心肌组织工程领域仍然面临巨大的困难和挑战，如何获得足够数量的种子细胞就是其中之一。并且工程化心肌组织移植到体内后，还需要维持其结构和功能，并与宿主心肌建立机械和电偶联，此外还要解决免疫排斥以及潜在的致瘤性等问题。这些问题都是我们需要一一攻破的。除了实验室培育的心肌结构外，更多研究理所当然地应该放在原位再生具有功能的心肌上。如上文所说的越来越多的资料证据开始打破我们的传统观念，表明心脏是具有自我再生能力的。将来的研究应该是进一步找到心脏祖细胞的特殊标志，以及控制心肌组织再生的其他因素的潜力。如果成功的话，这些策略将解决供体器官短缺的问题，而且还能用于梗死心肌或先天性心脏病的外科修复。而需要实现这些，都需要我们在大量实验中细细探究。
【参考文献】
细胞工程篇9
关键词 细胞工程实验课；教学平台；实验室；教学方式
中图分类号 G642.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）24-0329-01
Design and Implementation of Experiments in Cell Technology Teaching of Fisheries Universities
LI Xia QIN Yan-jie
（College of Fishery and Life，Dalian Ocean University，Dalian Liaoning 116023）
Abstract According to the teaching practice and extant problem in recent years ，the construction of the creative practical teaching platform of cell technology experiment was introduced in this paper.And the basic conditions in laboratory and teaching methods were brought forward.The initial exploration was provided for cultivating the abilities of creativity and practice of students to proride references for the development of cell technology experiment.
Key words cell engineering experiment；teaching platform；laboratory；teaching methods
细胞工程是一门现代生物科学理论和工程技术相结合的综合性学科，和基因工程、微生物发酵工程、酶工程一起构成生物工程的四大支撑课程，是生物科学、生物工程、生物技术专业的专业必修课。细胞工程实验是生物技术领域最新发展前沿的一门实验技能课程，学好这门课程将为学生今后从事生物学领域的相关研究及细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术基础[1-2]。动物细胞培养是细胞工程实验的主要内容。
目前全国各大高校基本都有生物技术或者生物工程专业，水产类的高校也不例外，如何办出特色一直是教学研究的重点。细胞工程作为专业课，除了讲授基本理论和实验技能外，更重要的是体现各校的特点。另外细胞工程实验由于难度大，对实验条件及教师素质要求高，而水产院校以往相关的条件不够好，所以实验开出率不高，有些实验只是演示或者根本不开，这在很大程度上影响了学生培养的质量。笔者根据多年科研和教学的经验，结合生物技术专业培养目标的要求，构建了细胞工程创新型实验教学平台，提出实验室基本条件以及教学形式，对如何解决目前细胞工程实验教学中存在的问题、提高学生实验技能和创新意识进行了初步的探讨。
1 构建创新型实验教学平台
为培养和提高学生的实验技能和创新能力，必须优化实验课结构，形成有利于创新型人才培养的实验课程体系。细胞工程实验应建立基础实验、综合（设计）型实验、研究型实验3个平台。
基础实验内容包括实验的准备、原代培养、传代培养、细胞计数及活力测定，主要是训练学生基本的细胞培养和无菌操作技能，使学生对细胞培养有全面、感性的认识。水产院校可以用学生比较熟悉的水生生物如扇贝、虾等为材料，采用组织块法或细胞酶解法进行。传代培养实验可选用鱼类细胞系等作为材料，如鲤鱼鳍细胞系。
综合型实验涉及相关的综合知识或运用综合的实验方法、实验手段，通常实验原理和操作较为复杂，要求学生会阅读和理解实验指导书的实验步骤，全面了解仪器设备的使用原理并能正确操作，锻炼学生综合分析问题的能力[3-4]。内容可包括细胞生长曲线的测定、培养细胞染色体制备、细胞的冻存和解冻等。如细胞生长曲线测定，实验室提供鱼类细胞系或骨髓瘤细胞为材料，建议使用24孔板，学生自己完成实验的过程。设计型实验完全以学生为主体，教师只起引导和辅助作用。可让学生自由分组进行，自行设计实验步骤，和教师讨论后自主实施。在实验过程中尽可能培养学生独立动手操作和思考的能力，让学生自己准备实验所需用品，实验室全天开放，设计型实验对培养学生团队精神，发挥学生的主观能动性和创造性是非常有益的。
研究型实验主要结合教师的科研和毕业论文来进行。科研与实验教学结合在培养本科生科研能力、创新意识、提高教学水平和质量，促进实验教学改革深入发展中起到重要作用[5-6]。教师可通过展示科研成果、提出研究中遇到的问题以及让学生承担一部分研究工作来达到对学生科研能力的培养。如学生完成的“泥鳅鳍细胞系的建立及特性分析”就是教师科研项目的一部分内容。
2 实验室应具备的基本条件
许多学校由于实验条件不足，造成实验课程不能开出。笔者结合多年经验设计出细胞工程实验室应具备的最基本的条件。细胞工程实验室应具备2个功能空间即准备室、实验操作室。准备室主要是器皿的清洗、包装、消毒、药品配置等，如果条件不允许可与实验操作室合并。实验操作室是学生实验操作的主体空间。由于全程要求无菌，所以需要安放超净工作台，若考虑实验空间和资金条件的因素，可以购买双人双面工作台，每个台上可操作4人。准备室的设备条件可参考微生物实验室，但倒置显微镜、CO2培养箱是实验操作室必备的[7]。条件允许的单位应单独设置保种室，用于实验教师对各种细胞系的保种及实验用细胞的准备工作，该保种室应按照生物安全防护三级实验室（P3）的规范进行设置。
3 优化教学方式方法
3.1 创造条件，尽可能满足实验要求
细胞培养对无菌条件要求较高，所以实验条件显得很重要。最好按1位教师指导15～20人来分配，学生着装要求白大衣和拖鞋，有条件的戴口罩，尽可能保证无菌操作。基础实验和综合（设计）型实验最好分开为2个学期。研究型实验可穿插其中直至毕业。
3.2 提高实验教师的素质
细胞的体外培养随时会面临各种各样的问题，如染菌、细胞生长不良等，要求实验教师针对各种突况灵活应对，以保证实验教学的顺利进行，同时，实验教师需要对学生的实验结果进行准确的分析和预测，从而对学生进行切实的指导。在研究型实验中更要从立题、实验操作、文献检索、讨论等各环节对学生进行指导，因此要求教师必须具备较高的科研素质和业务水平。
3.3 建立有效的成绩评定方法
实验课主要以学生的实际操作结果作为评定指标。每个相对独立的实验都有评定标准。如原代和传代培养，设及格、良、优3个等级。没有污染满足及格的要求，然后按生长情况分为其他2个等级。染色体制备实验分为3个标准，有少数分裂相为及格，分裂相较多为良，染色体伸展很好，着丝点清晰，可作核型和带型分析的为优。细胞冻存实验以解冻后细胞成活率为指标，成活率达85%为优秀，以后每降低5%，成绩即降一等。总成绩由各个独立的实验成绩综合得出。细致、综合的成绩评定方法对督促学生做好每一个实验有积极的作用。
4 结语
在高校培养人才的教育培训链条中，实验教学一直扮演着不可替代的重要角色[8]。在培养学生创新精神和创新能力方面，广大教育工作者都在积极地开展实验指导思路及方法的探讨[9-10]。高校培养的各类生物技术、生物工程专业的人才必将在生命科学、医药、农林、食品、生物资源与环境保护、养殖业、新物种的构建等领域中发挥着越来越重要的作用。高等教育的实验课程改革将为我国培养更多更好的创新人才，为把我国早日建设成创新型国家做出积极的贡献[1]。
5 参考文献
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细胞工程篇10
[关键词]SV-HUC-1；组织工程；尿道；上皮细胞系
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）03-0433-03
Study of the Possibility of Human Urethral Cell as Seed cell of Urethral Tissue Engineering
FAN Wei-wei,LV Wei,FAN Ju-feng
(Department of Plastic Surgery,Beijing Chaoyang Hospiatal of Capital Medical University,Beijing 100020,China)
Abstract: Objective To investigate the property of the 20th passage of SV-HUC-1 cell line.To study of the possibility of human urethral cell as seed cell of urethral tissue engineering. Methods We observed the morphology of the 20th SV-HUC-1 generation cell. RT-PCR and indirect immunohistochemistry dyeing were used to detect signal protein expression of the cells. Cell TrackerTM Blue CMF2HC was used to trace the live cells. Results The morphology of the 20th SV-HUC-1 cells was normal under the inverted phase contrast microscope. Vimentin and CK-18 was detected through RT-PCR and indirect immunohistochemistry dyeing. The 20th passage of SV-HUC-1 cells grew well after they were input Cell TrackerTM Blue CMF2HC. Conclusions The SV-HUC-1 cells can be culture to the 20th passage. They can express the signal protein of urinary epithelial cells. The morpaholgy of cells is regular. They can be investigated and traced with the live cells. The SV-HUC-1 cell line is a good choice of seed cells for urethral tissue engineering.
Key words: SV-HUC-1; tissue engineering; urethra; endothelial cell line
尿道下裂和尿道上裂的研究与组织工程化尿道的研究密切相关。但是来自人体和实验动物的成体细胞作为种子细胞的研究往往受限于种子细胞在培养传代一定代数后就会发生性质改变，从而无法进行大量传代而获得大量细胞。种子细胞的选择，成为了尿道组织工程研究的瓶颈之一。能否绕过种子细胞对于实验过程的干扰，找到为一种理论上可以反复传代而不发生变性的尿道黏膜上皮细胞作为种子细胞进行研究呢？笔者选择了人正常尿道上皮细胞系（SV-HUC-1），对其进行体外培养传代，并对其传代20代后的性质进行了检测。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞及主要试剂：人正常尿道上皮细胞系（SV-HUC-1）购自美国ATCC（产品编号CRL-9520 ）、F-12K培养基（美国Invitrogen公司）、胎牛血清（FBS）（美国HyClone公司）、胰蛋白酶（美国Sigma公司）。
1.2 主要仪器：CO2恒温培养箱（日本Napco公司，型号：5410）、超净操作工作台（北京半导体设备一厂）、倒置相差显微镜（日本Olympus公司）、低速离心机（北京医用离心机厂，型号：LD4-2）、电子精密天平（上海精科天平厂，型号：FA1104）、高温烤箱（日本Sakura公司，型号：HE-21）、超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所，型号：JY-96-2）。
1.3 实验方法
1.3.1 配制主要溶液：含10%FBS的F-12K培养液，胰蛋白酶（0.05%）-EDTA（0.02%）溶液，细胞冻存液。
1.3.2 细胞培养与传代：SV-HUC-1细胞以含10%灭活胎牛血清（FBS）的F-12K培养基在37℃、含5%CO2的培养箱内培养。每2天更换培养基，细胞生长至70%融合后用于后继实验。连续传20代，取细胞用于下一步鉴定。
1.3.3 细胞鉴定：将细胞裂解后提取总RNA，逆转录后得到cDNA，以波形蛋白（Vimentin）和角蛋白-18（CK-18）的引物进行扩增，得到相应大小的片段。以间接免疫荧光染色的方法对细胞的Vimentin和CK-18进行染色，进一步证实其蛋白的表达。
1.3.4 活细胞示踪：选择CellTrackerTM Blue CMF2HC (美国英杰公司，产品编号C12881)作为活细胞示踪剂，工作浓度为15μM，对生长至70%融合的第20代的SV-HUC-1细胞进行40min标记，然后PBS洗脱未进入细胞的示踪剂，换培养基继续培养48h后，以4%的甲醛固定。
2 结果
2.1 细胞培养：应用倒置相差显微镜观察生长至不同融合度的第20代SV-HUC-1细胞，可见其为形态正常的SV-HUC-1细胞（图1）。
2.2 细胞鉴定： 应用两种鉴定方法予以鉴定。应用RT-PCR法检测第20代SV-HUC-1细胞中Vimentin和CK-18的mRNA表达。应用间接免疫荧光法检测到第20代SV-HUC-1细胞中CK-18的蛋白质表达（图2）。上述两项鉴定实验证实第20代SV-HUC-1细胞中Vimentin和CK-18的mRNA均表达，从而明确该细胞具有的SV-HUC-1细胞的标志蛋白表达。
2.3 活细胞示踪：第20代SV-HUC-1细胞中加入活细胞示踪剂Cell TrackerTM Blue CMF2HC后，以荧光显微镜观察细胞的生长情况，SV-HUC-1细胞生长良好（图3）。
通过以上实验，证实了SV-HUC-1细胞能够正常生长传代20代，形态正常，能够表达泌尿系上皮细胞的标志蛋白，并能以活细胞的方式进行示踪和观察。
3 讨论
国内外有许多有关组织工程化尿道的研究，直接取自人体或动物的成体膀胱黏膜上皮细胞及尿道黏膜上皮细胞等泌尿系统上皮细胞是常用的种子细胞[1-8]，也有选用表皮细胞者[9-10]。
来自泌尿系统的上皮细胞无疑是最适用于尿道组织工程的种子细胞，但是由于直接取自人体或动物的成体泌尿系上皮细胞在经历若干代传代之后往往其性质发生较大变化，所以虽然个别作者报道能够在较短时间内获得大量扩增的尿道黏膜上皮细胞用于组织工程化器官构建[11]，但是大多数国内外在应用直接取自人体或动物的成体细胞作为种子细胞的进行研究时，其传代多为10代以内[1-10]。
但是，有很多实验需要大量的细胞进行研究，需要进行大量传代而获得大量细胞；另有很多研究目的不在于种子细胞，而是集中注意力于组织工程种子细胞与材料的复合方面的研究，因此就需要找到一种可以反复传代而不发生变性的尿道黏膜上皮种子细胞，这是能够保证很多实验顺利进行下去的前提。因此有必要寻找一种能绕过成体细胞难以大量传代的障碍，绕过种子细胞对于实验过程的干扰的方法。
如何解决这个问题呢？笔者考虑到应用SV-HUC-1细胞系，这种细胞来源于泌尿系上皮细胞，其特点在于能够无限传代下去。但是多次传代后SV-HUC-1细胞能够保持其原有性质吗？还适用于进行实验研究吗？本实验对于第20代SV-HUC-1细胞，应用倒置相差显微镜观察生长到其形态正常。并检测了第20代SV-HUC-1细胞的标志蛋白表达。应用RT-PCR法和间接免疫荧光法均检测到第20代SV-HUC-1细胞中Vimentin和CK-18的mRNA表达。应用研究活细胞示踪研究，在第20代SV-HUC-1细胞中加入活细胞示踪剂Cell Tracker? Blue CMF2HC后，以荧光显微镜观察细胞的生长情况，发现SV-HUC-1细胞生长良好。
通过以上实验，证实了SV-HUC-1细胞能够正常生长传代20代，形态正常，能够表达泌尿系上皮细胞的标志蛋白，并能以活细胞的方式进行示踪和观察。从这一角度为说，SV-HUC-1细胞系是适合作为尿道组织工程实验用的种子细胞。
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