蛋白质组学大牛利用DIA全面解析健康人体皮肤蛋白质组图谱

　　皮肤为人体提供物理屏障和免疫保护，这些功能由不同的功能层、细胞类型和细胞外基质来完成。尽管它在人类健康和疾病中发挥着核心作用，但皮肤的蛋白质组成还没有被系统地研究过。

　　为探讨这个问题，蛋白质组学领域大牛Matthias Mann的研究团队结合先进的组织解剖方法，流式细胞术和先进的DIA蛋白质组学策略，对人类皮肤进行了空间分辨定量的蛋白质组图谱描绘，成功地获得了包含10701个蛋白质的蛋白质组图谱，这是迄今为止从人类皮肤获得的最大的蛋白质组数据集。该成果于2020年11月5日发表于国际权威期刊《Nature Communications》。

　　

　　实验材料

　　人类健康皮肤组织、免疫细胞，约60+样本

　　技术路线

　　

　　研究结果

　　1. 人类皮肤的深入定量蛋白质组学图谱

　　首先，研究人员利用不同的方法分别获得了内外表皮、真皮和皮下组织、角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养细胞、免疫细胞、黑素细胞和内皮细胞。这些样本构成了皮肤组织的完整深度及其主要细胞类型。

　　

　　为了建立一个深度皮肤蛋白库，研究人员采用了分级策略，并使用DDA数据采集模式进行分析，共鉴定到了10701个蛋白质。这对于皮肤组织的蛋白组而言，达到了一个前所未有的覆盖深度。这个数据库在全蛋白质组水平为研究皮肤功能和组成提供了良好的基础。随后，他们利用DIA数据采集模式进行了定量蛋白组分析。

　　

　　结果显示，大多数蛋白质(6025; 56.3%)在四层均有表达，只有少数蛋白(569;5.3%)只在某一层中表达。这些发现与之前对其他组织的研究一致，表明大多数表达的蛋白在多种组织类型均存在，但不同组织之间同一蛋白质丰度差异很大。

　　

　　2. 皮肤蛋白质组的空间梯度

　　为了讨论不同分层皮肤组织的功能特征，研究人员利用DDA数据及进行了深入分析。首先，他们分析了表皮中的47种皮肤角蛋白(KRTs)、使外层肌肤具有机械稳定性的谷氨酰胺转胺酶以及真皮中提供结构支架和弹性的相关糖蛋白，蛋白组学数据证实了这些蛋白质在皮肤中处于执行这些功能的良好位置。

　　除了结构上的作用外，皮肤同时扮演着主动和被动的免疫屏障的角色。因此，接下来研究人员分析了具有免疫功能的蛋白质的空间梯度。其中S100家族蛋白成员具有非常明显的空间分布。

　　此外，蛋白组学数据还表明，皮肤存在广泛的免疫活性蛋白库，包括趋化因子（CXCL12/14）、抗菌肽（防御素β1/β2）、基质金属蛋白酶（MMP2/3/9）和细胞因子等。综上所述，这些分析对人体皮肤中不同的结构和细胞类型中的免疫活性蛋白进行了细致的定量蛋白质组学比较。

　　3. 培养成纤维细胞和角化细胞的蛋白质组图谱

　　接下来的分析中，研究人员进一步关注了皮肤中的组成细胞类型，并选择DIA策略对不同细胞类型的蛋白组进行比较。

　　此前有报道称，内皮唾酸蛋白（CD248/TEM1）是皮肤成纤维细胞内表达的蛋白。蛋白组结果显示，内皮唾酸蛋白位于成纤维细胞蛋白质组的前三分之一，其他类型的细胞中几乎没有检测到。因此，研究人员使用内皮唾酸蛋白的丰度曲线作为参照，以确定具有相似丰度模式的TOP100蛋白质。

　　与角质形成细胞相关性最好的TOP100蛋白质包括：细胞间黏附蛋白（cornifelin plakophilin 3、TNS4 DSG3, LAD1）,上皮细胞转化和分化相关蛋白（FAM83B ZNF185）和KLK5，以及角质细胞特异性血管舒缓素。此外，还发现了一些在角质形成中没有功能特征的蛋白。

　　

　　值得注意的是，在单层培养细胞中，许多角质形成细胞过程已知的重要功能蛋白并没有被鉴定出来。由于这些蛋白在相关的皮肤层较易被识别，这些差异可能证明了培养的角质形成细胞与体内角质形成细胞之间的生物学差异。

　　4. 细胞亚群蛋白质组分析探索新蛋白

　　由于样品量的限制，人类皮肤细胞亚群的蛋白质组学深度分析一直存在技术瓶颈。在这项研究中，研究人员制备了从健康人的皮肤新鲜分离的单细胞悬液，并制备了34个样品进行DIA蛋白质组学分析。分析中使用了包含内皮细胞、黑素细胞、树突细胞、肥大细胞、巨噬细胞和PBMCs在内的细胞亚群的深层蛋白质组作为DIA的比对数据库。

　　PCA分析直观呈现了包括培养的亚群在内的各个细胞亚群之间的共性和差异。层次聚类分析显示，不同细胞类型呈现带有明显不同蛋白簇分布。这些蛋白簇中，研究人员发现了39个激酶和16个泛素蛋白连接酶，它们在皮肤中的功能尚未确定。接下来，研究人员对各个细胞类型的蛋白表达谱进行了分析。从层次聚类和表达谱分析中获得的这些特征蛋白集，可能存在与这些皮肤细胞类型相关的功能蛋白质。综上所述，上述研究整合揭示了大量在皮肤中功能尚未定义的的蛋白质，为进一步的探索提供了良好的基础。

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