温故知新｜母乳及配方乳中糖巨肽对体外婴儿双歧杆菌增殖活性的影响

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　　本文发表于《中华围产医学杂志》2016年7期相关推荐 

　　1、我的成果我来说｜田瑞华—高病毒载量乙型肝炎病毒感染孕妇孕期服用抗病毒药物后不同喂养方式对母婴传播的影响：一项前瞻性队列研究2、短时消毒对母乳主要生物活性物质及免疫细胞的影响3、我国母乳成分研究的历史与现状

　　本文引用格式：石卉, 郑少伟, 黄龙光, 等.  母乳及配方乳中糖巨肽对体外婴儿双歧杆菌增殖活性的影响 [J] . 中华围产医学杂志,2016,19 (7): 528-533. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2016.07.010

　　石卉　郑少伟　黄龙光　周伟作者单位：510120  广州市妇女儿童医疗中心新生儿科（石卉、郑少伟、黄龙光、周伟）；443000 湖北省宜昌市第一人民医院儿科（郑少伟）通信作者：周伟，Email：zhouwei_pu002@126.com

　　【摘　要】

　　目的　探讨母乳及配方乳中糖巨肽对体外婴儿双歧杆菌增殖活性的影响以及量效关系。方法　成熟乳取自2014年9月广州市妇女儿童医疗中心就诊的广州地区身体健康、无特殊饮食习惯、生活安定、奶量充足的30例产妇，从母乳中分离出酪蛋白，通过凝乳酶水解酪蛋白分离糖巨肽，再使用超滤和离子交换色谱法纯化人乳糖巨肽。将牛乳糖巨肽及人乳糖巨肽按一定浓度（0、250、500、1 000、1 500、2 000和3 000 mg/L）添加至婴儿双歧杆菌液体培养基，进行厌氧培养，通过比浊法（检测培养基OD600 nm值）确定婴儿双歧杆菌浓度，比较人乳和牛乳糖巨肽促进婴儿双歧杆菌增殖活性的差异。采用两独立样本t检验进行统计学分析。结果　人乳纯化的糖巨肽浓度为1 712.20 mg/L，纯度为80.3%。培养基中牛乳糖巨肽浓度在250~2 000 mg/L的范围内增加其初始浓度，可以提高双歧杆菌的菌体浓度和增殖速率。培养36 h时，不同糖巨肽浓度下，双歧杆菌的生长均处于对数生长期，因此选取36 h作为双歧杆菌浓度的观察时间点。当培养36 h，培养基中糖巨肽浓度分别为1 000、1 500、2 000和3 000 mg/L时，人乳糖巨肽培养基中双歧杆菌浓度分别为2.255±0.036、2.583±0.088、2.877±0.080和3.219±0.081，均高于牛乳糖巨肽培养基中的浓度（分别为2.115±0.053、2.312±0.064、2.542±0.090和2.894±0.076），差异均有统计学意义（t值分别为4.867、5.569、6.192和6.516，P值均＜0.01）。结论　牛乳糖巨肽及人乳糖巨肽在体外均具有促进婴儿双歧杆菌增殖的活性。在相同浓度时，人乳糖巨肽促双歧杆菌增殖活性高于牛乳糖巨肽。【关键词】　乳，人；婴儿配方；酪蛋白类；肽碎片；二裂菌属基金项目：中国疾病预防控制中心妇幼保健中心合生元母婴营养与健康研究项目（2014FYH024）

　　母乳是新生儿营养的“金标准”，也是最适宜的营养食品。但是，有的母亲因为健康等原因不得不选择人工喂养。因此以母乳为标准，不断完善配方乳的研究一直没有停止过。糖巨肽是凝乳酶水解κ-酪蛋白所得到的C末端亲水性糖肽，因其肽链结构上结合了大量的碳水化合物而得名。糖巨肽具有一些重要的生物活性，如抑制胃液分泌、调节免疫系统反应、抑制病原体（病毒和细菌等）黏附至细胞、结合霍乱和埃希大肠杆菌的肠毒素、促进双歧杆菌生长等[1]。因此糖巨肽对于新生儿的营养以及新型配方乳的研究也具有重要价值。但是，人乳和配方乳（即牛乳）中糖巨肽的结构、含量均有一定差异。与牛乳糖巨肽比较，人乳糖巨肽的肽链多一个氨基酸残基，且部分位点的氨基酸残基也不同，比如牛乳中106、113、117、118、127、128位点的蛋氨酸（Met）、天冬酰胺（Asn）、苏氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）和甘氨酸（Gly），在人乳中分别为异亮氨酸（Ile）、异亮氨酸（Ile）、异亮氨酸（Ile）、异亮氨酸（Ile）、苏氨酸（Thr）和缬氨酸（Val）。在糖巨肽的结构中，这种差异共有28处，且人乳糖巨肽的碳水化合物部分也更为丰富[2]，人乳中糖巨肽含量显著高于配方乳[3]。但人乳和牛乳中糖巨肽的生物活性或量效关系是否相同，目前相关研究十分有限。因此，本研究通过比较糖巨肽在体外促双歧杆菌增殖活性的差异，探讨人乳和配方乳糖巨肽的活性差异，为开发更优质的配方乳提供一定理论依据。材料与方法一、母乳来源及处理母乳（产后42 d左右的成熟乳）取自2014年9月广州市妇女儿童医疗中心就诊的广州地区身体健康、无特殊饮食习惯、生活安定、奶量充足的30例产妇，母乳置于无菌离心管内，－70 ℃ 冰箱保存。研究获得产妇及家属的知情同意和本院医学伦理委员会批准。二、材料、仪器及来源婴儿双歧杆菌模式菌冻干粉，菌种编号为GIM1.207（广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心）；凝乳酶（美国Sigma公司）；牛乳糖巨肽（丹麦ARLA公司）；唾液酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；分光光度计（德国Eppendorf公司）；细菌培养箱（美国Thermo公司）；D201、D280、D290、D296R和201×4（凝胶型）阴离子交换树脂（天津南开和成科技有限公司）；厌氧产气袋（日本Mitsubishi公司）。三、研究方法 1. 人乳糖巨肽的分离纯化：（1）酪蛋白的分离：冻融母乳混合后取2 000 ml分装入50 ml离心管，4 ℃10 400×g离心30 min，去除上层脂肪；调整pH至4.3，加入CaCl2，使其浓度达到60 mmol/L，静置1 h，4 ℃ 400 00×g离心30 min，再使用乙醇洗涤，收集底层酪蛋白。（2）采用凝乳酶水解酪蛋白获得糖巨肽：通过超滤[4]和层析[5]的方法处理上清液，将人乳酪蛋白水解后的上清液，按照体积1︰1加上40 mmol/L的Tris-HCl，pH 7.0，终浓度为20 mmol/L，然后超滤浓缩到4 ml，上样；上离子交换柱，流穿液为上柱后流出的液体；采用低浓度的NaCl洗脱杂蛋白；高浓度的NaCl洗脱目的蛋白。分离纯化后的样本通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，得到纯化后的人乳糖巨肽。糖巨肽含量的检测采用唾液酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）法，通过检测蛋白光密度（optical density，OD）值分析糖巨肽的纯度[糖巨肽纯度=（OD210 nm－OD280 nm）/OD210 nm×100%]，4 ℃保存。2. 婴儿双歧杆菌的培养及鉴定：（1）盐溶液的配置：电子天平称取CaCl2 0.2 g，NaCl 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，NaHCO3 10.0 g，MgSO4·7H2O 0.48 g，加入1 000 ml蒸馏水使其充分溶解，并调整pH值为6.5，4 ℃保存。（2）平板培养基（ATYP琼脂培养基）的配制：量取上述盐溶液40.0 ml及5.0 g大豆蛋白胨、5.0 g胰胨、10.0 g酵母提取物、10.0 g葡萄糖、0.5g L-半胱氨酸和15.0 g琼脂于锥形瓶中，移液器量取0.1%刃天青1.0 ml，然后用双蒸水定容至1 000 ml，混匀后调整pH值至7.0，121 ℃高压灭菌15 min，培养基温度降至60 ℃左右，铺琼脂平板，凝固后4 ℃保存。（3）液体培养基的配制：培养基成分除琼脂外，其余与平板培养基相同，121 ℃高压灭菌15 min，小剂量分装，4 ℃保持。（4）试验组培养基：将牛乳糖巨肽、人乳糖巨肽按不同浓度添加至液体培养基中，配制时使用0.22 μm微孔滤膜过滤糖巨肽溶液，以除去其中的细菌。（5）活化菌株在ATYP琼脂培养基上传代2~3代，待细菌性状稳定后挑取菌落，制成菌悬液，菌液浓度约1.5×108 cfu/ml。然后使用96孔板进行细菌培养。每孔加入100 μl菌液和100 μl液体培养基（添加了牛乳糖巨肽、人乳糖巨肽的实验培养基），放入密封厌氧袋中，37 ℃培养72 h，每隔12小时取出一次，在600 nm下测定培养基吸光度（OD600 nm）值，每个处理组设5个复孔，取均值。以培养时间为横坐标，菌悬液OD600 nm值为纵坐标，绘制双歧杆菌生长曲线。开放密封袋后更换厌氧产气袋。（6）鉴定：革兰染色后显微镜下观察。双歧杆菌革兰染色为阳性，菌体宽约0.5 μm，长度在1~6 μm之间（图1）。

　　

　　3. 牛乳糖巨肽和人乳糖巨肽对双歧杆菌增殖的影响：（1）分别配制不同浓度的牛乳糖巨肽/人乳糖巨肽培养液：250、500、1 000、1 500、2 000和3 000 mg/L；另设0 mg/L作为对照组（未添加糖巨肽）。（2）双歧杆菌培养：在96孔板上取7×5的孔位，每个浓度5个复孔，按上述方法进行细菌培养，并记录OD600 nm值，获得不同糖巨肽浓度、不同培养时间下的双歧杆菌浓度，并绘制生长曲线。（3）观察添加糖巨肽后对双歧杆菌生长的影响，以及细菌对数生长期的时段，确定一个最佳的观察时间点。

　　四、统计学分析

　　采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析。正态分布计量资料采用x±s描述，采用两独立样本t检验比较组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　结　果

　　一、人乳糖巨肽的浓度与样品纯度

　　分离纯化后的人乳糖巨肽浓度为1 712.20 mg/L；样品纯度为（1.597－0.314）/1.597×100%=80.3%。

　　二、牛乳糖巨肽的促双歧杆菌增殖效应

　　根据不同牛乳糖巨肽浓度及不同培养时间培养基中的双歧杆菌浓度绘制生长曲线（图2和表1）。可见，培养基中糖巨肽浓度在250~2 000 mg/L的范围内增加其初始浓度，可以提高双歧杆菌的菌体浓度和增殖速率。培养36 h时，不同糖巨肽浓度下，双歧杆菌的生长均处于对数生长期，因此选取36 h作为双歧杆菌浓度的观察时间点。

　　

　　

　　三、人乳糖巨肽和牛乳糖巨肽促双歧杆菌增殖效应的差别

　　培养36 h时，培养基中糖巨肽浓度为1 000、1 500、2 000和3 000 mg/L时，人乳糖巨肽促进双歧杆菌增殖的效应更强，差异均有统计学意义（P值均＜0.01）。见表2。

　　

　　讨　论在糖巨肽的各种生物活性中，有一种类似于益生元的功能，即促进双歧杆菌增殖的活性。双歧杆菌是1899年由法国学者从母乳喂养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰阳性杆菌，在婴幼儿和成人肠道内一直维持着较高的菌种数量[6-7]。作为一种益生菌，近年来一直受到研究者的关注。双歧杆菌在预防和治疗多种肠道疾病（如腹泻病等）中发挥着非常有益的作用，除此之外，它还可以改善维生素和其他营养物质的代谢，改善肝脏功能，预防和改善龋齿，促进钙的吸收，且对婴儿湿疹、复发性口腔炎、母乳性黄疸均有一定治疗效果。母乳喂养儿肠道内双歧杆菌等益生菌在数量上有着显著优势。Gyorgy等[8-9]首先发现人乳中存在双歧杆菌生长促进因子—糖巨肽，1984年研究发现凝乳酶或胃蛋白酶作用于人乳酪蛋白后释放的糖巨肽即使浓度较低也能够有效促进双歧杆菌生长[10]，人乳和牛乳糖巨肽中含有的N-乙酰神经氨酸可以促进双歧杆菌属的增殖，如短杆菌、双歧杆菌、婴儿双歧杆菌。因此本研究选取了糖巨肽促进双歧杆菌增殖的活性作为观察指标，对比牛乳和人乳糖巨肽的活性差异。鉴于细菌的生长分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期，人乳中的糖巨肽含量也随泌乳期、早产等因素而改变[11]，因此不便于选取某一特定的糖巨肽浓度和任意的细菌培养时间去做生物活性对比。故本研究重新配制了不同浓度的糖巨肽培养基，配对比较两者的活性差异，并且将细菌培养的计数观察时间控制在对数生长期，避免进入衰亡期后，细菌浓度下降，不能准确反映细菌的增殖情况。既往研究表明，即使在浓度很低的情况（500 mg/L）下糖巨肽也是有效的双歧杆菌增殖因子[12]，因此本研究尝试选取了更低的糖巨肽浓度（250 mg/L）作为最低添加浓度；另外，根据人乳中糖巨肽的浓度范围[11]以及糖巨肽的最大溶解能力，本研究选取了3 000 mg/L作为糖巨肽的最高添加浓度。本研究结果显示，在添加了糖巨肽的培养基中，双歧杆菌的增殖速度和细菌数量均有一定的增加。在一定浓度内，这种促增殖效应与浓度呈正相关。当培养基中糖巨肽浓度继续增加达到2 000 mg/L后，培养基中的双歧杆菌最大浓度已无明显增加，甚至在培养72 h后，双歧杆菌浓度出现下降（表1和图2）。这可能一方面与双歧杆菌的生长特性有关，双歧杆菌在代谢糖时能产生酸性物质，使pH下降，但它本身又是一种不耐酸的细菌，当pH值过低时，自身生长可能受到抑制[13]；另一方面与此时的细菌生长已进入了衰亡期有关。因此，根据图2的生长曲线，本研究选取了36 h作为观测细菌浓度的时间点。本研究还显示，在相同的浓度下，人乳和牛乳糖巨肽促双歧杆菌增殖效应并不完全相同。当浓度在500 mg/L以内，厌氧培养36 h后，牛乳糖巨肽和人乳糖巨肽的促双歧杆菌增殖效应差异无统计学意义，但当浓度达到1 000 mg/L以上时，人乳糖巨肽的促增殖效应均大于牛乳糖巨肽，且当培养基中牛乳糖巨肽的浓度达到2 000 mg/L（3 000 mg/L）时才与1 500 mg/L（2 000 mg/L）的人乳糖巨肽效应相当。糖巨肽是乳中κ-酪蛋白经凝乳酶水解后产生的两种多肽之一，目前直接测定乳中的糖巨肽水平比较困难，但由于κ-酪蛋白是酪蛋白中唯一含糖的蛋白质，其中唾液酸通过糖苷键与糖蛋白的糖链相连接，且集中在糖巨肽上，90%以上的糖巨肽结合糖链都含有唾液酸，故可以通过测定唾液酸水平间接测定样品中的糖巨肽含量[3]。由于本研究是用测定唾液酸浓度的方法来表示糖巨肽浓度，也就是说相同浓度的糖巨肽培养基中，唾液酸浓度也是相同的，但是同样浓度的人乳糖巨肽和牛乳糖巨肽在生物活性的表现上并不完全相同，那么是否可以认为，唾液酸并不是决定糖巨肽的促双歧杆菌增殖活性的唯一因素，可能还有其他的因素参与呢？目前已知的益生元主要为各种低聚糖[14]，而糖巨肽的糖链结构上又恰恰富含大量的低聚糖，这为糖巨肽的益生活性提供了一定的理论依据。研究显示，含GlcNac和末端含GlcNac低聚糖的糖巨肽能促进双歧杆菌生长[8]。且含唾液酸的糖是促进双歧杆菌生长的重要因素[12,15]。此外，关于低聚糖的研究也表明低聚糖具有滋养功能，能通过刺激肠道有益菌群（双歧菌和乳酸菌）生长繁殖，间接抑制有害菌生长，以维持肠道微生态平衡，从而保护婴儿肠道免受致病菌侵袭[16]。但也有些研究结论不全相同，例如有研究使用牛乳和山羊乳的糖巨肽作为碳源加入培养基，培养嗜热双歧杆菌和乳酸菌时发现，连接至糖巨肽的低聚糖并不是促进双歧杆菌生长所必需的[17]。这可能与牛、羊等物种的糖巨肽所富含的碳水化合物明显低于人乳有关[1]，过低的碳水化合物浓度可能导致糖巨肽本身的益生活性过低，正如本研究中当糖巨肽浓度低于500 mg/L时，人乳及牛乳糖巨肽的益生活性差异无统计学意义一样。而且，促进双歧杆菌生长不仅与糖巨肽中的糖部分有关，也与多肽部分有关[18]。因此糖巨肽中的唾液酸以及半乳糖等物质是否具有促进双歧杆菌增殖的活性还有待更深入的研究，又或者糖巨肽自身的肽链结构中是否存在相关的结构域有待进一步考证。当然，除了可以促进双歧杆菌增殖外，糖巨肽还具有其他有益的活性，这些生物活性同样与糖巨肽的碳水化合物部分和/或糖巨肽自身的肽链结构有着重要关系。例如：糖巨肽能和病毒、细菌结合，主要是因为其肽链上的单糖（唾液酸）与接受器有足够的相似性，能堵塞接受器，因此可抑制细菌和病毒黏附至细胞[19]。糖巨肽还可以抑制由4种致人流感病毒造成的凝血作用，流感病毒侵袭靶细胞时，如果细胞表面存在含有唾液酸的物质，流感病毒就与唾液酸结合，从而保护细胞免受感染[20]。糖巨肽还具有能够结合霍乱毒素的特性，当使用唾液酸酶处理糖巨肽时，它的这种抑制霍乱毒素的作用就会完全丧失[21]。肽链也在这种结合中起了一定作用，因为使用蛋白酶处理后其抑制霍乱毒素的作用也部分丧失了。如果从离子交换色谱中获得糖巨肽的一段肽链，其活性也下降[22]。所以，如果糖巨肽的生物活性只与唾液酸相关，那么可以初步认为两者活性是等效的，但如果其活性不全归因于唾液酸或低聚糖时，则不能简单地将两者等同，本研究则是后者的例证之一。当然，本研究是体外试验，体内可能存在更多的影响因素，因而尚不能充分说明在体内具有同样的量效关系，还需进一步研究。

　　参考文献

　　[1]黄龙光, 周伟, 吴圣楣. 糖巨肽的生物学作用及研究进展[J]. 国际儿科学杂志, 2010, 37(2):215-217,221. DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4408.2010.02.034

　　[2]Mercier JC, Chobert JM, Addeo F. Comparative study of the amino acid sequences of the caseinomacropeptides from seven species[J]. FEBS Lett, 1976, 72(2):208-214.

　　[3]瞿柳红, 黄龙光, 陶莉, 等. 母乳糖巨肽水平检测及其与多种初生婴儿配方奶粉的比较[J]. 中华实用儿科临床杂志, 2013, 28(8):613-616. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X. 2013. 08.016. 

　　[4]张秀媛, 庞春酉, 白殿海, 等. 超滤法分离纯化酪蛋白糖巨肽的研究[J]. 食品科技, 2010,35(1):211-213. DOI: 10.13684/j.cnki.spkj.2010.01.069.

　　[5]刁瑞丽, 闫亚丽, 陈庆森. 阴离子交换树脂分离酪蛋白糖巨肽工艺条件优化[J]. 食品科学, 2012,33(2):72-77.

　　[6]Collado MC, Isolauri E, Salminen S, et al. The impact of probiotic on gut health[J]. Curr Drug Metab, 2009, 10(1):68-78.

　　[7]Knight DJ, Girling KJ. Gut flora in health and disease[J]. Lancet, 2003, 361(9371):1831.

　　[8]Gyorgy P, Kuhn R, Rose CS, et al. Bifidus factor. II. Its occurrence in milk from different species and in other natural products[J]. Arch Biochem Biophys, 1954, 48(1):202-208.

　　[9]Gyorgy P, Jeanloz RW, von Nicolai H, et al. Undialyzable growth factors for Lactobacillus bifidus var. pennsylvanicus. Protective effect of sialic acid bound to glycoproteins and oligosaccharides against bacterial degradation[J]. Eur J Biochem, 1974, 43(1):29-33.

　　[10]Breidenbach T, Hoffmann MW, Becker T, et al. Drug interaction of St John's wort with cyclosporine[J]. Lancet, 2000, 355(9218):1912.

　　[11]郑少伟, 李菁, 唐继辉, 等. 中国部分地区产妇不同阶段母乳中糖巨肽含量分析[J]. 中华实用儿科临床杂志, 2015, 30(12): 941-944. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.12.016.

　　[12]Brody EP. Biological activities of bovine glycomacropeptide[J]. Br J Nutr, 2000, 84 Suppl 1:S39-46.

　　[13]舒国伟, 季丽媛, 陈合, 等. pH值及接种量对两歧双歧杆菌生长的影响[J]. 食品工业, 2011,32(4):4-5.

　　[14]杨远志, 李发财, 庞明利,等. 益生菌和益生元在功能性食品中的应用现状及展望[J]. 中国食品添加剂, 2009, (6):187-192.

　　[15]Idota T. Sialylated compounds in human milk and their physiological significance in infants[J]. Snow Brand R&D Reports, 1996, 106(1): 1-55.

　　[16]王艳艳, 彭咏梅. 人乳低聚糖研究进展[J]. 中国实用儿科杂志, 2009, 24(11):882-884.

　　[17]Robitaille G. Growth-promoting effects of caseinomacropeptide from cow and goat milk on probiotics[J]. J Dairy Res, 2013, 80(1):58-63. DOI: 10.1017/S0022029912000660.

　　[18]Azuma N, Kaminogawa S, Yamauchi K. Properties of glycomacropeptide and para-k-casein derived from human k-casein and comparison of human and bovine k-caseins as to susceptibility to chymosin and pepsin[J]. Agric Biol Chem, 1984,48(8):2025-2031. DOI: 10.1080/00021369. 1984. 10866443.

　　[19]Steijns J. Dietary proteins as the source of new health promoting bio-active peptides with special attention to glutamine peptide[J]. Food Tech Eur, 1996,3(1):80-84.

　　[20]Tanimoto M, Kawasaki Y, Shinmoto H. Process for producing κ-casein glycomacropeptides[EB/OL].(1990-04)[2015-12-30].wwww.cabdirect.org/abstracts/19910444109.html.

　　[21]Dosako S, Nishiya T, Deya E. Process for the production of κ-casein glycomacropeptide[EB/OL].(1991-10-29)[2015-12-30].www.freepatentsonline.com/5061622.html.

　　[22]Oh S, Worobo RW, Kim B, et al. Detection of the cholera toxin-binding activity of kappa-casein macropeptide and optimization of its production by the response surface methodology[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2000, 64(3):516-522.

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