GABA的制作方法

　　gabaa受体作为靶点在制备或筛选降血脂、治疗肥胖和/或改善代谢的药物中的应用技术领域1.本发明属于医药技术领域，具体涉及gabaa受体(gabaa receptor)作为靶点在制备或筛选降血脂、治疗肥胖和/或改善代谢的药物中的应用。背景技术：2.肥胖是导致糖尿病、心血管疾病、癌症等众多疾病的风险因素，严重危害着人类的健康。随着生活条件的改善，人们饮食结构的改变，全球肥胖人口迅速增长。2021年，国际期刊《the lancet diabetes&endocrionology》针对“中国肥胖问题”发表专刊，报道我国成年人肥胖患病率已达16.4％，超重高达34.3％，已成为全球肥胖人口最多的国家1-4。然而，目前治疗肥胖、有效减重的手段相对有限，因此，为了改善国民的生活质量、提升健康状况、预防慢病，探究肥胖治疗的新策略，研发更为安全、有效的肥胖干预手段刻不容缓。3.参考文献：4.1pan,x.f.,wang,l.&pan,a.epidemiology anddeterminants ofobesityin china.lancet diabetes endocrinol 9,373-392,doi:10.1016/s2213-8587(21)00045-0(2021).5.2zeng,q.,li,n.,pan,x.f.,chen,l.&pan,a.clinical management and treatment of obesity in china.lancet diabetes endocrinol 9,393-405,doi:10.1016/s2213-8587(21)00047-4(2021).6.3collaboration,n.c.d.r.f.trends in adultbody-mass index in 200countries from 1975to 2014:a pooled analysis of 1698population-based measurement studies with 19.2million participants.lancet 387,1377-1396,doi:10.1016/s0140-6736(16)30054-x(2016).7.4lu,j.,bi,y.&ning,g.curbing the obesity epidemic in china.lancet diabetes endocrinol4,470-471,doi:10.1016/s2213-8587(16)30007-9(2016).技术实现要素：8.本发明的目的在于提供gabaa受体作为靶点在制备或筛选降血脂、治疗肥胖和/或改善代谢的药物中的应用。gabaa受体与小肠油脂吸收能力密切相关，本发明所述应用为肥胖治疗、降血脂、改善代谢提供全新的药物靶点以及新的治疗手段。9.本发明提供了gabaa受体作为靶点在制备或筛选具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。10.本发明还提供了增强gabaa受体的表达水平的物质在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。11.本发明还提供了提高gabaa受体的敏感性或氯离子通道开放频率或增加氯离子内流或引起神经细胞超极化的物质在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。12.本发明还提供了gabaa受体激动剂和/或变构剂在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。13.优选的是，所述gabaa受体激动剂包括葛根素和/或葛根素的衍生物，或苯二氮类药物；所述苯二氮类药物包括氟硝西泮、地西泮、三唑仑和氟马西尼中的一种或两种以上。14.本发明还提供了抑制迷走神经背核(dmv)的神经兴奋性的物质在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。15.优选的是，所述抑制迷走神经背核的神经兴奋性的物质包括增强gabaa受体的表达水平的物质或提高gabaa受体的敏感性或氯离子通道开放频率或增加氯离子内流或引起神经细胞超极化的物质。16.本发明还提供了葛根素和/或葛根素的衍生物在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。17.本发明还提供了基因gabra1和/或基因gabrg2作为药物靶点在筛选具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。18.本发明提供了gabaa受体作为靶点在制备或筛选降血脂、治疗肥胖和/或改善代谢的药物中的应用。目前国际上尚无研究报道，迷走神经背核gabaa受体具有抑制小肠油脂吸收、降血脂、治疗肥胖及改善代谢的效应。本发明首次提出gabaa受体可作为肥胖治疗、降血脂、抑制小肠油脂吸收和改善代谢的药物靶点。本发明提供了迷走神经背核中gabaa受体(α1/γ2亚基参与构成的受体)作为药物靶点在降脂、减重、改善代谢药物中的应用；本发明的研究结果显示，葛根素(及其衍生物)是gabaa受体的激动剂和变构剂，葛根素(及其衍生物)通过脑干的gabaa受体能够抑制迷走神经背核的神经兴奋性，导致小肠油脂吸收能力受到抑制，进而降低血脂、减轻体重(治疗肥胖)和改善代谢，为减肥药的研发提供了实验数据和理论依据。附图说明19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。20.图1为本发明提供的化学遗传学策略论证迷走神经背核对小肠油脂吸收的调控作用结果图；其中，a为化学遗传学策略抑制迷走神经背核(dmv)神经元的实验流程图；b为化学遗传学策略抑制dmv神经元后，实验组与对照组的体重曲线记录图；c为迷走神经背核(dmv)被抑制后，血脂水平变化结果图；d为化学遗传学策略干预前后粪便排出甘油三酯结果图；e为化学遗传学策略抑制dmv空肠对甘油三酯等脂类营养物质的吸收结果图；21.图2为本发明提供的脑片电生理记录葛根素对迷走神经背核神经元的抑制作用结果图；其中，a为脑片电生理的操作展示图(记录电极的电极内液中有绿色荧光染料，以标记被记录的神经元细胞)；b为脑片电生理结果图(记录葛根素孵育期间及洗脱后dmv神经元的动作电位)，22.图3为本发明提供的肥胖小鼠模型中，葛根素可抑制小肠油脂吸收、减轻体重结果图；其中，a为肥胖小鼠模型腹腔注射葛根素的流程示意图；b为脑片cfos免疫荧光染色结果图，其荧光信号代表神经元活动；c为葛根素实验组与对照组，肥胖小鼠模型的体重曲线记录结果图；d为葛根素实验组与对照组，血脂水平的定量测定结果图；e为葛根素实验组与对照组，空肠中被吸收的甘油三酯测定结果图；f为油红染色代表图，直观呈现小肠中脂类营养的吸收；23.图4为本发明提供的葛根素与gabaa受体在迷走神经背核共定位染色结果图；24.图5为本发明提供的葛根素与gabaa受体的药物结合位点的冷冻电镜解析结果图；其中，a为葛根素与gabaa(α1β3γ2)受体结合的冷冻电镜结构展示图；b为电信号变化结果图；25.图6为本发明提供的特异性敲低gabra1可阻断葛根素对dmv神经元的抑制作用及减重、降血脂、改善代谢等效果结果图；其中，a为dmv特异性敲低gabra1肥胖小鼠模型，腹腔注射葛根素的流程示意图；b为脑片cfos免疫荧光染色结果图：c为dmv核团cfos染色信号的定量统计结果图；d为对照组、葛根素组与gα阻断组，肥胖小鼠模型的体重曲线记录结果图；e为对照组、葛根素组与gα阻断组，血脂水平的定量测定结果图；f为对照组、葛根素组与gα阻断组，空肠中被吸收的甘油三酯测定结果图；26.图7为本发明提供的特异性敲低gabrg2可阻断葛根素对dmv神经元的抑制作用及减重、降血脂、改善代谢等效果结果图；其中，a为dmv特异性敲低gabrg2肥胖小鼠模型，腹腔注射葛根素的流程示意图；b为脑片cfos免疫荧光染色结果图；c为dmv核团cfos染色信号的定量统计图；d为对照组、葛根素组与gγ2阻断组，肥胖小鼠模型的体重曲线记录结果图；e为对照组、葛根素组与gγ2阻断组，血脂水平的定量测定结果图；f为对照组、葛根素组与gγ2阻断组，空肠中被吸收的甘油三酯测定结果图；27.图8为本发明提供的葛根素衍生物对小肠油脂吸收的抑制、降低血脂及减轻体重结果图；其中，a为葛根素衍生物-1的化学结构式；b为对照组与衍生物-1组，肥胖小鼠模型的体重曲线记录结果图；c为对照组与衍生物-1组，血脂水平的定量测定结果图；d为对照组与衍生物-1组，空肠中被吸收的甘油三酯测定结果图；e为葛根素衍生物-2的化学结构式；f为对照组与衍生物-2组，肥胖小鼠模型的体重曲线记录结果图；g为对照组与衍生物-2组，血脂水平的定量测定结果图；h为对照组与衍生物-2组，空肠中被吸收的甘油三酯测定结果图；i为葛根素衍生物-3的化学结构式；j为对照组与衍生物-3组，肥胖小鼠模型的体重曲线记录结果图；k为对照组与衍生物-3组，血脂水平的定量测定结果图；l为对照组与衍生物-3组，空肠中被吸收的甘油三酯测定结果图。具体实施方式28.本发明提供了gabaa受体作为药物靶点在筛选具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。gabaa受体为神经细胞中的氯离子通道受体，生理状态下gabaa受体与γ-氨基丁酸(即gaba)结合，促使氯离子通道开放，从而导致神经细胞超极化状态，细胞元兴奋性受到抑制。29.本发明还提供了增强gabaa受体的表达水平的物质在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。30.本发明还提供了提高gabaa受体的敏感性或氯离子通道开放频率或增加氯离子内流或引起神经细胞超极化的物质在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。31.本发明还提供了gabaa受体激动剂(靶向脑干迷走神经背核gabaa受体的激动剂)和/或变构剂在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。利用冷冻电镜技术，发现葛根素作用于gabaa受体α1和γ2亚基之间的位点，葛根素可以与gabaa受体结合，促进氯离子通道更的开放，显著增幅γ-氨基丁酸对神经元的抑制效果，葛根素是迷走神经背核gabaa受体的激动剂。32.在本发明中，所述gabaa受体激动剂包括葛根素和/或葛根素的衍生物，或苯二氮类药物；所述苯二氮类药物包括氟硝西泮、地西泮、三唑仑和氟马西尼中的一种或两种以上。33.本发明还提供了抑制迷走神经背核的神经兴奋性的物质在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。哺乳动物脑干的迷走神经背核(dmv)核团支配着内脏运动、调控消化吸收的作用，gabaa受体富集表达于dmv。以往研究证明gabaa受体可作为镇静、抗焦虑、抗惊厥、缓解抑郁症的药物靶点；迷走神经背核gabaa受体作为治疗肥胖、降低血脂、改善代谢和抑制小肠油脂吸收的药物靶点的应用为本发明首次公开。本发明通过化学遗传学抑制小鼠迷走神经背核(dmv)的兴奋性，分析其体重曲线、血脂、小肠吸收等代谢指标，发现抑制dmv兴奋性能够抑制小肠油脂吸收。34.在本发明中，所述抑制迷走神经背核的神经兴奋性的物质包括增强gabaa受体的表达水平的物质或提高gabaa受体的敏感性或氯离子通道开放频率或增加氯离子内流或引起神经细胞超极化的物质。35.本发明还提供了葛根素和/或葛根素的衍生物在制备具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。葛根素是一类异黄酮化合物，是中药葛根的主要有效成分，其分子式如式i所示：[0036][0037]本发明通过脑片电生理分析，发现葛根素(及其衍生物)能够通过“dmv核团-gabaa受体-迷走神经-小肠营养吸收”(gabaa受体是在dmv核团相对特异性高表达；正常生理状态，内源性神经递质γ-氨基丁酸与gabaa受体结合，抑制神经元的兴奋性，葛根素与gabaa受体结合后，可增幅gabaa受体对γ-氨基丁酸的反应，即在接受少量γ-氨基丁酸的情况下，有葛根素的作用，迷走神经背核对小肠可产生更强的抑制效果)抑制迷走神经背核(dmv)的兴奋性，抑制小肠对油脂的吸收。在动物研究中证明葛根素(及其衍生物)能够通过迷走神经抑制小肠对脂类营养物质的吸收、促进未被吸收的油脂通过粪便排出，实现降血脂、减轻体重、治疗肥胖的疗效。[0038]利用葛根素探针，证明葛根素富集结合在迷走神经背核dmv核团，并与脑干gabaa受体呈现共定位染色；同时，借助冷冻电镜cryoem技术，本发明发现葛根素作用于脑干gabaa受体的药物靶点，其结合在gabaa受体α1和γ2亚基之间的位点，通过调控氯离子通道抑制迷走神经背核的神经兴奋性(即葛根素可以与gabaa受体结合，促进氯离子通道更的开放，显著增幅γ-氨基丁酸对神经元的抑制效果)。[0039]本发明还提供了基因gabra1和/或基因gabrg2作为药物靶点在筛选具有如①～④中任意一种或两种以上所示作用的药物中的应用：①降血脂；②治疗肥胖；③改善代谢综合症；④抑制小肠油脂吸收。通过shrna敲低gabra1(gabaa受体α1亚基的基因)或gabrg2(gabaa受体γ2亚基的基因)，证明了葛根素是通过gabaa受体发挥抑制小肠油脂吸收的作用。具体的，本发明通过gabra1shrna病毒(raav-dio-gabra1-shrna，brainvta,china)组织特异性敲低迷走神经背核的gabaa受体α1亚基的表达，在肥胖小鼠模型中论证了gabaa受体在葛根素抑制小肠油脂吸收、降血脂、减轻体重的效果，阐明“dmv核团-gabaa受体-迷走神经-小肠油脂吸收”的脑-肠调控途径。同理，本发明通过gabrg2shrna病毒raav-dio-gabrg2-shrna(brainvta，china)也证明了dmv组织特异性敲低gabrg2可阻断葛根素对迷走神经的抑制作用，干预其抑制小肠油脂吸收、减重、降脂的效果。[0040]为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的gabaa受体作为药物靶点在筛选降血脂、治疗肥胖和/或改善代谢的药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。[0041]实施例1[0042]1.实验动物模型的建立与检测[0043](1)肥胖动物模型的建立[0044]本发明中使用的c57bl/6j品系小鼠，实验小鼠均饲养在spf级环境、以12:12昼夜节律、温度保持22～24℃，并依据动物伦理相关规定对实验动物进行麻醉、止痛、手术、腹腔注射等实验操作。[0045]本发明以脂肪的质量百分含量为60％的高脂饮食饲喂小鼠12周，体重达到35g以上，即构建完成饮食性肥胖的动物模型；实验正式开展阶段(对应图1、图3、图6和图7中的a中的第0天开始)，小鼠单笼饲养，精准记录每只小鼠模型的每天的进食量、收集药物干预前后的粪便、并记录每日体重曲线。[0046](2)化学遗传病毒注射[0047]化学遗传学(designer receptors exclusively activatedby designer drugs，dreadds)是一种在动物模型中控制特定脑区神经元兴奋性的研究方法，其通过g蛋白偶联受体改造的aav病毒，在特定外源配体氯氮平n-氧化物(cno)激活其下游的信号通路，引起神经元兴奋性的改变。本发明以迷走神经背核为切入点，借助抑制型化学遗传病毒(raav-ef1a-dio-hm4d(gi)-mcherry-wpre-pa，购自枢密脑科学技术有限公司，brainvta,china)和其对照病毒(raav-ef1a-dio-mcherry-wpre-pa，购自枢密脑科学技术有限公司，brainvta,china)构建干预迷走神经背核的小鼠模型，具体实验操作如下：[0048]用戊巴比妥钠将小鼠深度麻醉，固定在脑立体定位仪上，开皮暴露颅面，根据bregma点定位到迷走神经背核(dmv坐标：-7.10mm，±0.2mm，-4.50mm)，颅钻钻孔，用微量进样器每侧注射300nl病毒，注射5分钟，稳定5分钟，注射完毕后用金霉素软膏涂抹颅面消炎，然后用缝合创面，置于37℃的热垫上恢复1小时后，将小鼠放回笼盒等待其苏醒。化学遗传抑制组和对照组分别在dmv核团注射抑制型化学遗传病毒(raav-ef1a-dio-hm4d(gi)-mcherry-wpre-pa，brainvta,china)和其对照病毒(raav-ef1a-dio-mcherry-wpre-pa，brainvta,china)两种病毒，其他操作完全一致。[0049]待手术恢复四周后，每天以1.0mg/kg bw剂量给化学遗传抑制组和对照组小鼠均腹腔注射氯氮平n-氧化物(cno，catalog no.bml-ns105,enzo life sciences,usa)，抑制迷走神经背核的神经活动，观察小鼠每日的摄食量、体重、并收集粪便。持续通过cno注射抑制迷走神经背核7天后，牺牲小鼠，收取小鼠组织样本，并进行生理代谢指标的检测与分析。[0050]2.生理代谢指标的检测与分析[0051]本发明涉及的生理代谢指标包括：血浆、肠组织和粪便等样品中甘油三酯(tg)、游离脂肪酸(nefa)的含量。[0052]测定样本中甘油三酯(tg)的方法如下：首先，称取20～30mg的样本，加入含5％np40的裂解液，匀浆后在95℃的金属浴加入5分钟，重复两次；冷却至室温后，以15000rpm转速离心2～3分钟，吸取上清液进行测定。使用biovision试剂盒测定甘油三酯，在每个孔中加入2μl上述样品上清液，显色反应后，通过酶标仪测定值。小肠组织的甘油三酯则以标准蛋白浓度进行定量；粪便样本通过测定值与24h样品总质量的计算得出随粪便排出的脂类总量。[0053]样品中游离脂肪酸(nefa)是通过异丙醇/氯仿/triton-100萃取的方式提取，在烘箱中50℃烘干，并以真空泵真空处理30分钟后，将样品溶解于5％np-40溶液中。随后，比较wako试剂盒(catalogno.294-63601,wako,japan).加入样品前后酶标仪定量的差值，定量样品中nefa。[0054]基于上述生理指标检测与分析实施方式，本发明主要检测动物模型的体重曲线、粪脂、肠脂、血脂等脂类代谢相关生理指标。[0055]图1为化学遗传学策略论证迷走神经背核对小肠油脂吸收的调控作用结果图。图1中的a是化学遗传策略的实验流程图：取8周龄的雄性小鼠构建饮食性肥胖小鼠模型，利用高脂饲料饲喂8周时将小鼠随机分为两组，分别在小鼠迷走神经背核dmv注射抑制型化学遗传病毒和其对照病毒，构建抑制组和对照组两组动物模型。继续高脂饲料4周后，使其体重达到35g以上，记录体重、收集粪便样本作为初始基准线，并计作“第0天”；从第1天开始腹腔注射cno通过化学遗传学策略激活dmv核团，每天注射cno一次，持续7天、并记录每日体重变化，在第7天注射cno后2小时牺牲小鼠，收集血液、粪便、小肠等组织，定量测量各样本中脂类成分，以获得图1中的b-图1中的e中的实验结果。[0056]化学遗传学抑制迷走神经背核dmv神经元后(即腹腔注射cno后)，抑制组肥胖小鼠体重逐渐降低，在dmv核团神经元被抑制7天后，体重显著低于对照组(图1中的b，表1)，血脂水平显著降低(图1中的c，表2)。如图1中的d和表3所示，化学遗传学策略干预前后(即注射cno前，以及注射cno7天后)相比较，在抑制组中大量未被吸收的甘油三酯可通过粪便排出体外；化学遗传学策略抑制dmv，通过空肠段吸收到小肠的甘油三酯等脂类营养物质显著减少(图1中的e，表4)。上述实验结果表明，迷走神经背核dmv的抑制，能够显著降低小肠油脂吸收、降血脂、减轻体重。[0057]表1体重曲线变化百分比(％)[0058][0059]表2血脂水平(mm)[0060][0061]表3粪便排出甘油三酯(μmol)[0062][0063]表4空肠甘油三酯水平[0064][0065]葛根素对肥胖小鼠的小肠油脂吸收抑制以及体重减轻的结果如图3所示，本发明同样通过上述生理指标检测与分析，明确了葛根素对肥胖小鼠的体重曲线、粪脂、肠脂、血脂等脂类代谢相关生理指标的改善作用。图3中的a是肥胖小鼠模型腹腔注射葛根素的流程示意图：如图所示，取8周龄的雄性小鼠，利用高脂饲料饲喂12周使其体重达到35g以上，将上述肥胖小鼠模型随机分为两组，分别在腹腔注射生理盐水和葛根素溶液，构建对照组和葛根素组动物模型。在腹腔注射葛根素前收集干预前的粪便样本、记录体重作为初始基准线，并计作“第0天”；从第1天开始每天腹腔注射一次生理盐水和葛根素溶液，持续20天、并记录每日体重变化，在第20天注射葛根素后2小时牺牲小鼠，收集血液、粪便、小肠、脑等组织，定量测量血脂、空肠甘油三酯等生理指标，并通过组织切片直接检测脑干迷走神经背核和小肠的形态学结果(包括脑片cfos免疫荧光染色试验和小肠油红染色试验)。[0066]脑片cfos免疫荧光染色如图3中的b所示，其荧光信号的数量代表神经元的兴奋性程度，是葛根素组和对照组脑片cfos染色的代表图，葛根素组在dmv脑区(迷走神经背核dmv核团)的cfos荧光信号数量少于对照组，表明迷走神经背核dmv的神经元兴奋性受到葛根素的抑制。记录葛根素注射期间，葛根素实验组与对照组的体重曲线(图3中的c，表5)，测量血脂(图3中的d，表6)；并通过biovision试剂盒检测空肠油脂吸收能力(图3中的e，表7)，如图3中的f所示是葛根素组与对照组油红染色的代表图，直观呈现小肠中被吸收的脂类总量。上述实验结果表明，葛根素可抑制迷走神经背核dmv神经元的兴奋性，并且小肠油脂吸收能力受到抑制、血脂降低、体重随着葛根素的注射逐渐减轻，能够达到减重降脂的效果。[0067]表5体重曲线变化百分比(％)[0068][0069]表6血脂水平(mm)[0070][0071]表7空肠甘油三酯水平(μmol/mg/protein)[0072][0073]3.脑片电生理实验[0074]取高脂饲喂12周的肥胖小鼠模型心脏灌流人工脑脊液(acsf)后，经震荡切片制备200～300μm厚的脑干组织切片；脑切片在35℃通氧孵育1小时后，将脑切片转移至膜片钳系统，进行全细胞膜片钳记录。在迷走神经背核根据细胞形态选取记录的神经元，并在电极内液加入绿色荧光染料标记细胞。本发明以电流钳模式连续记录基线、孵育葛根素和洗脱三个阶段，以明确药物的处理对dmv神经元的影响：首先在基线部分记录神经元自发动作电位1～3min；随后，持续记录自发动作电位并开始孵育葛根素(10mm浓度)，记录5～30min药物处理阶段的电生理信号；最后，记录acsf洗脱过程。[0075]脑片电生理记录葛根素对迷走神经背核神经元的抑制作用结果图如图2所示。[0076]图2中的a是脑干迷走神经背核脑片电生理的操作展示图，记录电极的电极内液中有荧光染料(绿色)可标记被电极记录的神经元，表明图2中的a中所记录的神经细胞(绿色荧光标记)是dmv核团的神经元。[0077]如图2中的b所示，脑片电生理结果表明，葛根素孵育期间迷走神经背核神经元的动作电位发放频率显著降低，膜电位略低于初始基准线。综上，葛根素可以抑制迷走神经背核神经元的电生理活动、抑制神经元的兴奋性，使dmv核团的神经元受到抑制。[0078]4.冷冻电镜解析葛根素与靶受体的药物结合位点；[0079]参考相关文献方法(dai j,liang k,zhao s,et al.chemoproteomics reveals baicalin activates hepatic cpt1 to ameliorate diet-induced obesity and hepatic steatosis.proc natl acadsci u s a.2018；115(26):e5896-e5905)，在脑片组织上对葛根素与gabaa受体进行免疫荧光染色，葛根素与gabaa受体在迷走神经背核共定位染色结果如图4所示。图4显示了葛根素的结合空间特异性及靶受体的共定位，葛根素探针富集结合在迷走神经背核(dmv)，并与gabaa受体的染色呈现较好的共定位，表明葛根素的作用靶点可能是迷走神经背核的gabaa受体。根据公开的国际数据库allen brain atlas中各基因的表达谱，由α1β3γ2构成的gabaa受体(http://mouse.brain-map.org/gene/show/14170)富集表达在dmv核团，可能是葛根素在dmv核团的分子靶点。[0080]本发明根据文献(laverty,d.et al.cryo-em structure of the human alpha 1beta3gamma2 gabaa receptor in a lipid bilayer.nature 565,516-520)报道，构建了在迷走神经背核富集表达的gabaa受体五聚体形式α1β3γ2gabaa受体的293s稳转细胞系，α1亚基携带flag标签，用于蛋白纯化，获得2l左右的细胞悬液。超声破碎细胞后利用超速离心机获得细胞膜沉淀；4℃条件用去垢剂溶解细胞膜2小时后，高速离心获得膜溶液，膜溶液通过与anti-flag树脂共孵育，从而获得gabaa受体蛋白；再以分子筛获得纯度较高的蛋白质溶液。将蛋白溶液浓缩至2mg/ml以上，并与葛根素共孵育30分钟，获得结合有葛根素gabaa受体蛋白样本。[0081]制备冷冻电镜样本：准备已辉光放电的多孔碳膜铜网，将3μl药物-受体结合溶液滴至铜网表面，吸走多余液体后迅速将铜网放置在液态乙烷中冷冻至玻璃态，并储存在液氮中以备冷冻电镜拍摄采集。[0082]样本利用300kv fei titan krios冷冻电镜采集单颗粒数据，共获取到142931个单颗粒蛋白的图像，将各角度的电镜图像进行聚类分组、各角度的平均2d图、傅里叶运算、3d模型重建，最终获得分辨率的冷冻电镜图谱。[0083]图5为冷冻电镜解析：葛根素与gabaa受体的药物结合位点结果图。其中，a为葛根素与gabaa(α1β3γ2)受体结合的冷冻电镜结构展示图；在此分辨率的gabaa受体结构中，葛根素与gabaa受体在原子层面的药物结合位点，其位于gabaa受体α1亚基与γ2亚基之间，葛根素结合的靶点包括α1亚基的h102、v203-q204-s205、t207、y210以及γ2亚基的d56-m57-y58、n60、f77、a79等位点，可作为gabaa受体在肥胖治疗药物制备的核心药物靶点；b为在上述293s细胞系中，孵育0.5μm gaba可引起gabaa(α1β3γ2)受体开放氯离子通道，产生生物电信号的变化(图5中的b，左图)；若将0.5μm gaba与葛根素共孵育3～5分钟，则会引起更多氯离子进入细胞内，发生超极化、使细胞呈现抑制静默状态(图5中的b，右图)。[0084]如图5所示，冷冻电镜解析葛根素与gabaa受体在原子层面的药物结合位点，其位于gabaa受体α1/γ2亚基之间，葛根素结合的靶点包括α1亚基的h102、v203-q204-s205、t207、y209以及γ2亚基的d56-m57-y58、n60、f77、a79等位点，可作为gabaa受体在肥胖治疗药物制备的核心药物靶点。[0085]如图6所示，利用raav-dio-gabra1-shrna(brainvta，china)在肥胖小鼠模型(高脂饲喂12周获得)中敲低迷走神经背核的gabra1(编码gabaa受体α1亚基的基因)，同时将不包含靶基因的病毒载体raav-dio-mcherry(brainvta，china)作为对照组。[0086]图6中的a为特异性敲低gabra1可阻断葛根素的实验流程示意图：如图所示，取8周龄的雄性小鼠构建饮食性肥胖小鼠模型，利用高脂饲料饲喂8周时，将上述肥胖小鼠模型随机分为三组：(1)dmv核团注射对照病毒，4周后腹腔注射生理盐水，作为对照组；(2)dmv核团注射对照病毒，4周后腹腔注射葛根素溶液，作为葛根素组；(3)dmv核团注射gabra1shrna病毒，4周后腹腔注射葛根素溶液，作为gα1阻断组；上述三组动物模型，在腹腔注射葛根素或生理盐水前记录体重、收集粪便样本作为初始基准线，并计作“第0天”。从第1天开始每天腹腔注射一次生理盐水或葛根素溶液，持续7天、并记录每日体重变化，在第7天注生理盐水或射葛根素后2小时牺牲小鼠，收集血液、粪便、小肠、脑等组织，定量测量血脂、空肠甘油三酯等生理指标，并通过组织切片直接检测脑干迷走神经背核和小肠的形态学结果。[0087]图6中的b的脑片cfos免疫荧光染色结果表明，葛根素组的cfos染色少于对照组，dmv神经元受到了抑制(图6中的b，中图)；而组织特异性敲低gabra1(gα1阻断组，图6中的b，右图)会干预葛根素对dmv神经元的抑制作用；如图6中的c和表8所示，上述三组cfos染色的信号定量统计，也表明dmv的gabaa受体α1亚基在葛根素抑制神经元兴奋性过程中发挥着必要作用。比较对照组、葛根素组和gα1阻断组之间的体重曲线、血脂及空肠所吸收的甘油三酯水平(图6中的d、图6中的e(表9)和图6中的f(表10))，说明dmv组织特异性敲低gabra1可阻断葛根素对迷走神经的抑制作用，干预其抑制小肠油脂吸收、减重、降脂的效果，表明gabaa受体α1亚基是葛根素在肥胖治疗应用中的靶点。[0088]表8体重曲线变化百分比(％)[0089][0090]表9血脂水平(mm)[0091][0092]表10空肠甘油三酯水平(μmol/mg/protein)[0093][0094]与上述实验相似，利用raav-dio-gabrg2-shrna(brainvta，china)在肥胖小鼠模型中敲低迷走神经背核的gabrg2(编码gabaa受体γ2亚基的基因)，raav-dio-mcherry(brainvta，china)作为对照组，图7中的a为特异性敲低gabrg2可阻断葛根素的实验流程示意图：取8周龄的雄性小鼠构建饮食性肥胖小鼠模型，利用高脂饲料饲喂8周时，将上述肥胖小鼠模型随机分为三组：(1)dmv核团注射对照病毒，4周后腹腔注射生理盐水，作为对照组；(2)dmv核团注射对照病毒，4周后腹腔注射葛根素溶液，作为葛根素组；(3)dmv核团注射gabrg2 shrna病毒，4周后腹腔注射葛根素溶液，作为gγ2阻断组；上述三组动物模型，在腹腔注射葛根素或生理盐水前记录体重、收集粪便样本作为初始基准线，并计作“第0天”。从第1天开始每天腹腔注射一次生理盐水或葛根素溶液，持续7天、并记录每日体重变化，在第7天注生理盐水或射葛根素后2小时牺牲小鼠，收集血液、粪便、小肠、脑等组织，定量测量血脂、空肠甘油三酯等生理指标，并通过组织切片直接检测脑干迷走神经背核和小肠的形态学结果。[0095]比较对照组、葛根素组和gγ2阻断组dmv核团的cfos染色结果(图7中的b)及进行定量统计(图7中的c，表11)；结合图7中的c的定量统计结果，根据图7中的b，中图可知，dmv神经元的cfos染色信号受到葛根素的抑制作用；再根据图7中的b，右图可知，组织特异性敲低gabrg2可干预葛根素对dmv神经元的抑制作用。记录腹腔注射葛根素后的体重曲线(图7中的d)、测量血脂(图7中的e，表12)和空肠所吸收的甘油三酯(图7中的f，表13)，说明dmv组织特异性敲低gabrg2可阻断葛根素对迷走神经的抑制作用，干预其抑制小肠油脂吸收、减重、降脂的效果，表明gabaa受体γ2亚基是葛根素在肥胖治疗应用中的靶点。[0096]表11体重曲线变化百分比(％)[0097][0098]表12血脂水平(mm)[0099][0100]表13空肠甘油三酯水平(μmol/mg/protein)[0101][0102]综上，迷走神经背核gabaa受体α1亚基和γ2亚基是葛根素减重、降脂作用的药物靶点，同时，迷走神经背核gabaa受体可作为药物靶点在降血脂、治疗肥胖和改善代谢中广泛应用，本发明保护迷走神经背核与gabaa受体作为肥胖症治疗药物靶点的应用。[0103]本发明通过化学合成的方法获得葛根素衍生物(娄红祥,孙斌,崔昌义.葛根素衍生物及其制备方法和在预防、治疗心脑血管疾病或糖尿病及其并发症中的用途[p].:cn201710464386.5,20200228；王林,张首国,彭涛,吕秋军.葛根素及其衍生物的合成与初步活性研究[a].in:2005年全国药物化学会议[c].2005.187-187；张彬.葛根素衍生物及其转化的吡唑类化合物的合成研究[d].陕西科技大学,2016)，并对各衍生物在减重、降脂与肥胖治疗应用中的效果进行了实验论证，如图8中的a-图8中的d和表14～表16所示，葛根素衍生物-1腹腔注射期间可显著降低肥胖小鼠的体重(图8中的b)、抑制甘油三酯在小肠中的吸收(图8中的d)、并有效降低血脂水平(图8中的c)。葛根素衍生物-2、葛根素衍生物-3均呈现抑制小肠油脂吸收、降低血脂和减轻体重等作用(图8中的e-图8中的l，和表17～表22)。[0104]表14葛根素衍生物-1组体重改变百分比(％)[0105][0106]表15葛根素衍生物-1组血脂水平(mm)[0107][0108]表16葛根素衍生物-1组空肠的甘油三酯水平(μmol/mg/protein)[0109][0110]表17葛根素衍生物-2组体重变化曲线(％)[0111][0112]表18葛根素衍生物-2组血脂水平(mm)[0113][0114]表19葛根素衍生物-2组空肠的甘油三酯水平(μmol/mg/protein)[0115][0116]表20葛根素衍生物-3组体重变化曲线(％)[0117][0118]表21葛根素衍生物-3组血脂水平(mm)[0119][0120]表22葛根素衍生物-3组空肠的甘油三酯水平(μmol/mg/protein)[0121][0122]综上所述，gabaa受体可通过“dmv核团-gabaa受体-迷走神经-小肠营养吸收”途径抑制小肠油脂吸收，实现降血脂、减轻体重和治疗肥胖的目标。本发明涉及的葛根素(及其衍生物)作为gabaa受体激动剂，促进氯离子通道开放，抑制dmv神经活动，进而促进机体排油、降脂的目标。[0123]上述gabaa受体调控的脑-肠轴机制，可作为制备肥胖治疗药物靶点的应用。[0124]尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。