抗菌药物使用对儿童幽门螺杆菌检测方法的干扰

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是消化性溃疡及胃癌等疾病的重要病因。50% 的 Hp 感染始发于儿童期[]，因此儿童期 Hp 感染的筛查、确诊及根除有着重要意义。目前所有的 Hp 检测方法均建议在检测前尽量规避相关药物影响 1 个月以上，尤其是抗生素使用，因其对各种检测方法的灵敏度及特异度有较大干扰[]。但儿童期是上呼吸道感染、肺炎、腹泻等感染性疾病的高发期，很多儿童的消化道症状与呼吸道疾患同时发生。加之家属心情焦虑、医患关系紧张等因素，儿童抗菌药物过度使用已是我国临床普遍存在的问题。我们在临床工作中发现，许多儿童在疑诊 Hp 感染需进行 Hp 检测时，常常有近期抗菌药物使用病史，且多数患儿的抗菌药物使用目的并非为了根除 Hp。由于家长焦虑、时间有限、要求尽快检测、尽快用药等具体情况，很多患儿常在有药物干扰的情况下进行 Hp 检测。“非根除 Hp 为目的”的抗菌药物使用已经严重干扰了 Hp 检测的准确性。这是儿科医生常常面对的现状。在抗菌药物影响下，如何判读 Hp 检测结果、分辨检测结果真伪，是消化儿科医生常要面对的棘手问题。本研究将针对这一常见临床问题，了解在抗菌药物干扰下，不同 Hp 感染检测方法的灵敏度变化，以期提出合理临床建议，减少误诊及漏诊。现报告如下。

　　按以下标准前瞻性收集我院 2015 年 6 月—2017 年 12 月门诊及住院部患儿，抗菌药物组与对照组各 200 例。

　　① 我院门诊及住院部患儿，临床高度疑诊 Hp 感染相关疾病，因临床诊疗需要，必须完善胃镜检查者；② 胃镜检查前 4 周内，因各种原因使用过各种抗生素；③ 年龄≥3 岁，能配合完成碳 13 尿素呼气试验（13C-urea breath test，13C-UBT）。

　　① 近 4 周内同时服用过磷酸铝、铝碳酸镁、铋剂等黏膜保护剂；② 近 4 周内同时服用过质子泵抑制剂及其他制酸剂；③ 近 4 周内因各种原因服用过中药；④ 不能完成后续外周血采集、大便采集及尿素呼气试验等检测，不合作的患儿。

　　① 我院门诊及住院部患儿，临床高度疑诊 Hp 感染相关疾病，需要完善胃镜检查患儿；② 胃镜检查前 4 周内，未使用过任何抗菌药物；③ 年龄≥3 岁，能配合完成尿素呼气试验。

　　同抗菌药物组排除标准。

　　研究涉及的临床试验已通过四川大学华西第二医院伦理委员会批准［（2015）伦审批第（48）号］，并于中国临床试验中心注册（注册号：ChiCTR-DDD-16010273）。所有患儿家属均被告知相关事宜及风险，均同意加入研究，并签署同意书。

　　询问记录所有纳入患儿 Hp 检测前用药情况，包括服用抗菌药物种类、用药时间、用药原因等相关信息。所有纳入患儿在胃镜检查时，同时行胃窦及胃体黏膜活检，活检标本进行快速尿素酶试验（rapid urease test，RUT），并送病理检查。完成胃镜检查后，患儿立即进行 13C-UBT 及取外周指血 1 滴进行 Hp 免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）抗体检测。同时收集患儿大便保存待检。研究中，所有纳入患儿均分别使用以下 5 种方法进行 Hp 检测。

　　胃镜检查下，于胃窦及胃体部位各取活检标本 1 块，分别行胃窦及胃体 2 个部位的 RUT 试验。活检标本浸于胃 Hp 诊断试剂盒（福建三强生物化工有限公司）试剂中孵育，24～25℃ 下，观察颜色变化，试剂由黄色变红色为阳性，不变色为阴性。在第 15 分钟时进行第 1 次结果判读，待时间延长至第 30 分钟时，进行第 2 次结果判读。

　　患儿空腹 4 h 以上进行检测，检查过程中保持安静状态。受检患儿先空腹呼气，收集本底气体。然后饮服浴于 100 mL 冷开水中的 13C-尿素试剂（尿素 13C 散剂呼气试验药盒，75 mg，协和药业有限公司）。30 min 后再次收集服用 13C-尿素后呼气样本。服用试剂前后的呼气样本，用 WLD600C 13C 呼气分析仪（北京万联达信科仪器有限公司）进行同位素比值谱仪分析，前后样本检测超基准值的差值即检测结果，检测结果≥4.0 为阳性，<4.0 为阴性。

　　所有患儿胃镜检查时，同时取胃窦及胃体 2 个部位活检，每个部位各取 1 块，行 W-S 法显微镜检查 Hp。活检组织石蜡包埋后切片，切片脱蜡至蒸馏水，用 1% 硝酸银在 43℃ 水浴浸染 30 min，显色液显色 5～15 min，镜下观察组织呈浅棕黄色，同时显色剂变成棕黑色即终止染色，54℃ 热自来水冲洗终止显色。切片再经脱水、透明、封固后显微镜下检查（镜检）。所有切片由同一病理科医生镜检并判断结果。镜下发现棕黑色短棒状弧形细菌，背景呈灰黄或黄棕色，即诊断 Hp 阳性。显微镜下观察到 Hp 细胞壁部分或全部丧失而细胞膜保持完整，细菌的形态呈现高度多形性改变，即可认定为 Hp 发生 L 型改变[]。L 型改变的发生率=发现 L 型改变的例数/对应部位 Hp 阳性例数×100%。

　　采集患儿外周指血 1 滴，进行 Hp 现症抗体（IgM 抗体）检测。HP 抗体检测试剂盒（Genelabs Assure TM）购自安倍医疗器械贸易（上海）有限公司（GLD’s Hp RT，MP Biomedicals）。按试剂盒说明书严格操作，1 滴指血滴入检测卡，15 min 后读取结果。A 线为质控线，B 线为现症感染 IgM 线（current infection marker，CIM 线）—现症感染条带 IgM 抗体，C 线为测试线—既往感染条带 IgG 抗体。根据酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理，CIM 线、质控线和测试线均显色，即认定为“现症感染阳性”。仅 A 线及 C 线显色提示既往感染，非现症感染。

　　酶联免疫分析双抗体夹心法检测患儿新鲜大便 HpSA。按 HpSA ELISA 检测试剂盒（协和药业有限公司）说明书程序进行操作。收集新鲜粪便标本于 0.5 h 内送检，并冻存于–80℃ 液氮待检，检测同时设立阳性及阴性对照。取 50 mg 大便标本，稀释于 1 mL 生理盐水中，取粪便滤液 100 μL 加入包被了抗 Hp 抗体的滴定板孔中，加入酶标抗体，震荡 20 s，25℃ 孵育 60 min，洗涤滴定板孔 6 次后，加入底物液震荡 30 s，25℃ 孵育 10 min，加入反应停止液后 15 min，在酶标仪上测定 450/650 nm 吸光度，根据界限值判定结果，吸光度≥0.12 为阳性，吸光度<0.12 为阴性。

　　采用 SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用 t 检验；计数资料用例数（百分数）表示，两组间比较采用四格表 χ2 检验，不同检测方法间的比较采用行×列表 χ2 检验及配伍组设计的 χ2 检验。检验水准 α=0.05。

　　抗菌药物组及对照组患儿每组各收集 200 例。抗菌药物组患儿男 108 例，女 92 例，平均年龄（6.81±1.98）岁，平均病程（14.18±7.29） d。对照组患儿男 112 例，女 88 例，平均年龄（6.79±2.13）岁，平均病程（12.98±6.89） d。两组患儿性别、年龄、病程差异无统计学意义（P<0.05）。

　　所有抗菌药物组患儿中，仅有 25 例（12.5%）患儿使用抗菌药物的目的是为根除 Hp，这 25 例患儿均为两联使用抗菌药物，其中 20 例使用阿莫西林+克拉霉素，5 例使用阿莫西林+甲硝唑。其余 87.5% 的患儿均因呼吸道感染、发热、腹泻、腹痛、呕吐等病因，近期有使用过下列各种抗菌药物。多数患儿的近期抗菌药物使用，并非以根除 Hp 为目的。见。

　　抗菌药物组 RUT 检测阳性率低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。胃窦部及胃体部联合活检，并延长检测时间为 30 min 可提高阳性检出率。见。

　　抗菌药物组阳性率低于对照组，且抗菌药物组阳性定量值低于对照组阳性测定值的 50% 以下，差异均有统计学意义（P<0.05）。见。

　　抗菌药物组活检标本中，Hp 菌量多少不一，但普遍较对照组菌量明显减少，散在分布在腺体陷窝中。抗菌药物组标本中 L 型改变很常见（80.9% 可见），菌体呈球形样变，或萎缩变形，分布稀疏。抗菌药物组胃窦部活检阳性率仅为 42.0%，明显低于对照组（P<0.05），胃体及胃窦部联合活检有利于提高阳性检出率。抗菌药物组胃镜下活检总的 Hp 阳性率为 48.0%，低于对照组的阳性率（68.0%），抗菌药物组 Hp 的 L 型变发生率远高于对照组，两组之间差异有统计学意义（P<0.05）。见。

　　两组患儿的 IgG 抗体阳性率差异无统计学意义（P>0.05）；但抗菌药物组 IgM 抗体阳性率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见。

　　抗菌药物组与对照组的 HpSA 阳性率分别为 38.0%（76/200）和 69.0%（138/200），差异有统计学意义（χ2=9.986，P<0.001）。抗菌药物干扰下 HpSA 检测的灵敏度有明显下降。

　　5 种检测方法中，抗菌药物组的阳性率均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。抗菌药物组中，以 13C-UBT 阳性率最高（vs. RUT、W-S 法、HpSA，P<0.05；vs. 血 IgM 抗体，χ2=7.111，P=0.004）。见。

　　Hp 感染是儿童期非特异性腹痛及消化性溃疡的重要病因[]。50% 的 Hp 感染始发于儿童期[]，我国儿童 Hp 自然感染率约为 17%[]。目前所有的 Hp 相关指南中均提到“检测与治疗策略”[-]。Hp 感染的治疗均基于准确的 Hp 检测。而目前所有 Hp 检测方法都建议规避相关药物干扰至少 1 个月[-]。尤其是“与 Hp 根除相关的抗菌药物”使用，对 Hp 检测准确性影响极大[]。我们在临床上发现，儿童 Hp 感染的确诊往往受众多因素干扰，包括患儿症状叙述不清、检查不配合、对侵袭性检测情绪抵触、家属情绪焦虑、要求未确诊先诊断性用药等。且儿童为呼吸道感染、胃肠炎等疾病的高发人群，多数患儿在行 Hp 检测前常因各种原因使用过抗菌药物，难以达到规避药物 1 个月以上。我科 5 年来数千例儿童胃镜检查显示，RUT 的总体阳性率不足 5%，远远低于正常人群感染率[]及内镜下影像提示 Hp 感染率。究其原因，我们发现 50%～60% 的患儿近期使用过抗菌药物，且多数为呼吸道感染、腹泻、呕吐、发热等病因，抗菌药物使用多数不是为了根除 Hp。很多患儿需补充多项检测方能确诊 Hp 感染。“非 Hp 根除性”的抗菌药物使用已严重干扰了儿童 Hp 检测的准确性。既往研究多针对几种有限的根除 Hp 相关的抗菌药物，对于品种更多的儿童其他疾患常用抗菌药物，尚无报道探讨过其对 Hp 检测的干扰状况。

　　目前 Hp 检测方法很多，总体分为侵袭性及非侵袭性两类，每种方法都各有利弊，适用范围不同。既往关于 Hp 检测敏感性及特异性的文献，将抗生素服用者列为排除对象，均是无抗生素干扰下的结果[]。而实际临床上，儿童因 Hp 根除使用抗菌药物并不多，更多的时候使用抗菌药物不是为了进行 Hp 根除，且很难避免。Hp 根除性抗菌药物（阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑等）对 Hp 检测的干扰常有报道，但其他类别的儿科呼吸道常用抗菌药物对 Hp 检测的干扰状况如何，未见报道。因国外抗菌药物控制相对严格，此类情况未见报道。我国儿科抗菌药物确实存在过度使用问题，针对这一现状，尚未见相关临床调研。在此次研究中，我们发现，在近期使用过抗菌药物的患儿中，有 87.5% 的患儿是因呼吸道感染、发热等其他原因使用抗菌药物，真正涉及 Hp 根除性的抗菌药物使用者仅占 12.5%。众所周知，阿莫西林等 Hp 根除相关性抗菌药物会抑制 Hp 增殖，导致 Hp 检测假阴性[]。本研究结果显示，头孢菌素类、阿奇霉素等呼吸道常用抗菌药物，也会导致 Hp 阳性检出率显著下降，这些种类的抗菌药物是通过直接抑制 Hp 增殖，还是通过改变微生态环境间接抑制 Hp 增殖，机制尚不清，但本研究结果显示其他类别的抗菌药物使用也会严重干扰 Hp 检出率。在这些抗菌药物使用后的短期内检测 Hp，假阴性率大大增高。

　　RUT 是胃镜下常用的 Hp 检测方法，因 Hp 在胃中的分布不均，且受限于取材部位及点状活检，此法的敏感性及特异性都较低。我们的检测结果显示，高度疑诊 Hp 感染的患儿中，对照组的阳性率为 75.0%。而抗菌药物使用组的阳性率则降低了近一半，检测敏感性大大下降。如果多部位活检，并加倍延长显色时间可将阳性率由 29.0% 提升至 36.5%，但仍有大量的患儿漏诊。13C-UBT 是 Hp 诊断的金标准。我们的研究结果显示，13C-UBT 在 5 种 Hp 检测方法中最敏感，尽管较对照组阳性率仍有显著降低，但较其他几种检测方法，阳性率仍然最高。在抗菌药物使用干扰下，13C-UBT 的测定值较对照组降低 50% 以上。可见在抗菌药物干扰下，即使 13C-UBT 在低阈值状态也有显著临床意义，对于这部分低阈值患儿，有必要后期复查及随访了解 Hp 携带状况。病理活检因受限于取材部位及 Hp 分布的局灶性，其敏感性原本不高。在抗菌药物干扰下，其阳性检出率也大大降低，并且 Hp 的 L 型变很常见，胃窦及胃体部位 L 型变的发生率分别为 80.9% 及 67.9%。若配合多点活检，病理检查敏感性仍远远高于 RUT，因此对于内镜下表现符合 Hp 感染征象，疑诊 RUT 假阴性的患儿，建议同时多点活检行 Hp 特殊染色，并务必提醒病理科医生注意观察，以免因 Hp 分布稀疏及 L 型变而漏诊。血液 Hp-IgM 抗体检测在 5 种检测方法中敏感性仅次于 13C-UBT，因其仅需 1 滴指血，显示结果快速，是儿童 Hp 检测的优选方法。从原理上说 IgM 抗体检测应该不受抗菌药物使用的干扰，但我们发现，抗菌药物使用组的抗体检出率仍低于对照组。究其原因，可能受抗菌药物干扰后，Hp 生长缓慢、增殖抑制、机体载菌量下降，使 IgM 抗体产生延迟或含量过低，导致检测假阴性。但总体而言 IgM 抗体检测敏感率仍较高，此方法不失为检测失败者的优选补充方案。HpSA 检测因其无痛苦性，在儿童患者常有采用，但其敏感性及特异性较低，常常作为流行病学人群感染率调查的方法[]，如果用于临床确诊，受限于采样误差及菌体载量不同，容易漏诊。我们的检测结果显示，在抗菌药物使用干扰下，因 Hp 抑制状态，细菌载量大大下降，HpSA 检测阳性率降低近一半，其协助诊断的价值不大。同时，对照组检测结果显示，若无抗菌药物干扰，RUT 与 13C-UBT 阳性率接近，二者敏感性较高。而病理活检、IgM 抗体检测及粪便抗原检测的阳性敏感率较为接近。

　　从我们的研究结果可见，在儿童 Hp 检测前 1 个月，多种抗菌药物的使用都会干扰降低 Hp 的检出率，其不仅限于有限的几种“根除 Hp 相关抗菌药物”，更多的“非根除 Hp 相关抗菌药物”也会严重干扰 Hp 检测。受限于儿童的多病性、治疗紧迫性及家长时间安排等现实因素，临床上常常被迫在抗菌药物干扰下行 Hp 检测。针对这一现状，我们的研究结果显示，13C-UBT 是首选推荐的方法，其敏感性高，且无创无痛苦。而对于小年龄婴幼儿，因其不能配合呼气动作，无法进行 13C-UBT，则首选推荐指血 IgM 胶体金法检测，该法痛苦性小，准确性较高。而 HpSA 检测及血 IgG 抗体检测临床参考价值较低。对于临床需要完成胃镜检查的患儿，若内镜征象疑诊 Hp 感染，但 RUT 阴性，需警惕 RUT 假阴性可能，建议务必同时完成多点病理活检协助 Hp 检测，因 RUT 在抗菌药物干扰下漏检率极高。

　　综上所述，本研究对临床上抗菌药物干扰儿童 Hp 检测的现状进行了分析，为儿科医生对结果判断提供经验借鉴，并提出优选方案及组合建议，希望能协助儿科医生正确评判检测结果，避免漏诊及盲目用药。