人源化细胞系

　　人源化细胞系1.相关申请的交叉引用2.本技术要求于2019年2月8日提交的美国申请no.62/803,266的申请日的权益，其公开内容通过引用并入本文。3.政府权利的声明4.本发明是在国立卫生研究院(national institutes of health)授予的hhsn272201400008c的政府支持下完成的。政府对本发明具有某些权利。背景技术：5.甲型和乙型流感病毒具有两种主要的表面糖蛋白，血细胞凝集素(hemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(neuraminidase，na)。ha识别细胞表面上的包含唾液酸的受体，而na从细胞表面上的受体上切割唾液酸，以促进子代病毒颗粒从受感染细胞的表面释放(gamblin和skehel，2010)。ha也是刺激宿主保护性免疫，特别是产生中和抗体的主要抗原。6.从临床样本中分离病毒是用于确定和表征传播中的(circulating)病毒的必要工具。目前，甲型流感病毒的两种亚型(a/h1n1和a/h3n2)和乙型流感病毒的两种谱系(b/yamagata谱系和b/victoria谱系)在人群中共同传播并且引起季节性流感的流行。马丁?达比犬肾(madin?darby canine kidney，mdck)细胞是用于分离和繁殖人流感病毒的最广泛使用的细胞系。该细胞系显示出对流感病毒的高易感性；然而，它对近期a/h3n2病毒的生长支持不佳。此外，流感病毒在mdck细胞中的传代通常导致选择在其ha和/或na基因上具有突变的变体(chambers et al.，2014；lee et al.，2013；tamura et al.，2013；lin et al.，2017；li et al.，2009；oh et al.，2008)。携带与流感病毒适应细胞培养相关的突变的这样的变体的出现可使对传播中的流感病毒的抗原、遗传和抗病毒特性的评价失真。例如，赋予a/h3n2病毒na以受体结合活性的突变(例如在第151位的天冬氨酸至甘氨酸的替换(d151g)(moh et al.，2015；lin et al.，2010；zhu et al.，2012))的出现对于通过血细胞凝集抑制、病毒中和和减焦测定(focus reduction assay)来表征ha抗原性是有问题的，因为na的受体结合活性有助于这些测定的结果。然而，许多实验室使用mdck细胞来分离a/h3n2病毒。lee et al.(2013)的gisaid epiflu数据库分析显示约30％的经mdck培养的a/h3n2分离株在第151位具有氨基酸变化。因此，目前传播中的a/h3n2毒株应在可忠实维持其特征的细胞系中进行分离和繁殖。7.人流感病毒的ha喜好与以通过α2，6键与半乳糖连接的唾液酸结束的聚糖结合，而禽病毒ha优先与以通过α2，3键与半乳糖连接的唾液酸终止的聚糖结合(connor et al.，1994；rogers and paulson，1983；stevens et al.，2006)。相应地，在人上呼吸道中的上皮细胞主要表达α2，6?唾液聚糖(van riel et al.，2006；shinya et al.，2006)。尽管表达α2，6?唾液聚糖和α2，3?唾液聚糖二者的mdck细胞适合于从多种动物物种中分离流感病毒，但该细胞系已显示出表达相对低水平的α2，6?唾液聚糖(lin et al.，2017；hatakeyama et al.，2005；matrosovich et al.，2003)。先前，我们小组和其他小组改造了mdck细胞以使α2，6?唾液聚糖过表达(hatakeyama et al.，2005；matrosovich et al.，2003)。这些经修饰的mdck细胞(定名为ax4或mdck?siat1)对人流感病毒分离显示出比常规mdck细胞系更高的敏感性(oh et al.，2008；hatakeyama et al.，2005)，但其仍表达α2，3?唾液聚糖。重要的是，与常规mdck细胞一样，当季节性流感病毒通过mdck?siat1细胞传代时，已检测到具有ha或na突变的变体(tamura et al.，2013；li et al.，2009)。因此，支持高效分离和繁殖人流感病毒而没有任何细胞培养适应性突变的替代细胞系对于准确表征传播中的病毒是必要的并且可能用于在细胞中高效产生疫苗。技术实现要素：8.本公开内容涉及哺乳动物或禽细胞系，其被遗传修饰成支持例如更高效地分离和/或扩增(繁殖)人流感病毒，并且特别是人h3流感病毒。相对于未经修饰成改变α?2，3连接的唾液酸、α?2，6连接的唾液酸或二者的表达的亲本细胞系，所公开的细胞系可被遗传修饰成降低细胞表面上α?2，3连接的唾液酸的表达并且提高α?2，6连接的唾液酸的表达。在一个实施方案中，经修饰的哺乳动物或禽细胞系被修饰成表达高水平的人流感病毒受体和低水平的禽流感病毒受体。在一个实施方案中，细胞系是哺乳动物细胞系，例如，非人细胞系，例如灵长类细胞系或犬细胞系。在一个实施方案中，经修饰的细胞系是经修饰的mdck细胞系，其相对于ax?4具有降低的α?2，3连接的唾液酸的表达或相对于未经修饰的mdck细胞具有提高的α?2，6连接的唾液酸的表达。在一个实施方案中，经修饰的细胞系是hck，其与mdck和ax?4细胞相比，支持更高效分离和扩增人流感病毒。在一个实施方案中，α?2，3连接的唾液酸的表达降低是由于降低或消除产生α?2，3连接的唾液酸的一种或更多种唾液酸转移酶的表达的遗传修饰，遗传修饰包括但不限于一个或更多个唾液酸转移酶基因中的一个或更多个核苷酸插入、一个或更多个核苷酸缺失、一个或更多个核苷酸替换，或其任意组合。在一个实施方案中，遗传修饰包括一个或更多个唾液酸转移酶基因中的一个或更多个核苷酸插入。在一个实施方案中，遗传修饰包括一个或更多个唾液酸转移酶基因中的一个或更多个核苷酸缺失。在一个实施方案中，遗传修饰包括一个或更多个唾液酸转移酶基因中的一个或更多个核苷酸替换。在一个实施方案中，遗传修饰包括至少一个唾液酸转移酶基因中的一个或更多个核苷酸插入。在一个实施方案中，遗传修饰包括至少一个唾液酸转移酶基因中的一个或更多个核苷酸缺失。在一个实施方案中，遗传修饰包括至少一个唾液酸转移酶基因中的一个或更多个核苷酸替换。降低α?2，3连接的唾液酸的表达的基因修饰可以是“敲低(knock down)”或“敲除”表达的任何方法的结果，方法包括使用重组酶系统，例如crispr/cas、talen或锌指结合蛋白。在一个实施方案中，α?2，6连接的唾液酸的表达提高是由于提高产生α?2，6连接的唾液酸的一种或更多种唾液酸转移酶的表达的遗传修饰，遗传修饰包括但不限于这样的表达盒，其包含编码产生α?2，6连接的唾液酸的唾液酸转移酶的核苷酸序列，例如人β?半乳糖苷α2，6?唾液酸转移酶i(st6gal i)基因。9.在一个实施方案中，提供了分离的重组哺乳动物或禽细胞，其相对于对应的非重组哺乳动物或禽细胞包含降低量的细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基和提高量的人β?半乳糖苷α2，6唾液酸残基。在一个实施方案中，分离的重组细胞是非人哺乳动物细胞。在一个实施方案中，分离的重组细胞是犬或非人灵长类细胞。在一个实施方案中，在重组细胞中，表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基的量降低是一种或更多种α2，3唾液酸转移酶的量或活性降低的结果，例如一种或更多种α2，3唾液酸转移酶的量或活性降低至少5％、10％、20％、50％、70％、80％、90％、95％或更多，可导致α2，3唾液酸残基降低至少5％、10％、20％、50％、70％、80％、90％、95％或更多。在一个实施方案中，在重组细胞中α2，3唾液酸转移酶的量或活性或者α2，3唾液酸残基的量是不可检测的。在一个实施方案中，经修饰的α2，3唾液酸转移酶基因编码与seq id no.6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的α2，3唾液酸转移酶，或者与seq id no.5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，分离的重组细胞包含编码人β?半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶i(st6gal?i)或st6gal?ii的表达盒。在一个实施方案中，st6gal?i或st6gal?ii包含与seq id no.1至4、101或150中的任一个具有至少80％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在一个实施方案中，α2，6唾液酸转移酶基因编码与seq id no.1至4、101或150中的任一个具有至少85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的α2，6唾液酸转移酶，或者与seq id no.101或151具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，在重组细胞中人β?半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶的量或活性提高了至少1％、5％、10％、20％、50％、70％、80％、90％、95％或更多。在一个实施方案中，一种或更多种β?半乳糖苷α2，3唾液酸转移酶基因发生突变以降低细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基的量。在一个实施方案中，st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gal?iv、st3gal?v、st3gal?vi或st3gal?ii样基因中的两种或更多种发生突变。在一个实施方案中，st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gal?iv、st3gal?v、st3gal?vi或st3gal?ii样基因中的三种、四种、五种、六种或七种发生突变。在一个实施方案中，st3基因与seq id no.5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少80％的核酸序列同一性。在一个实施方案中，细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基的降低是一种或更多种st3唾液酸转移酶表达降低的结果。在一个实施方案中，一种或更多种st3唾液酸转移酶与seq id no.6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少80％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，相对于非重组细胞，h3流感病毒在重组细胞中更高效地复制。10.还提供了分离的重组哺乳动物或禽细胞，其相对于对应的非重组哺乳动物或禽细胞包含降低量的细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基。在一个实施方案中，重组细胞中st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gal?iv、st3gal?v、st3gal?vi或st3gal?ii样基因中的一种或更多种发生突变。在一个实施方案中，重组细胞中st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gαl?iv、st3gal?v、st3gal?vi或st3gal?ii样基因中的组合发生突变。在一个实施方案中，重组细胞中st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gal?iv、st3gal?v、st3gal?vi和st3gal?ii样基因发生突变。11.本文所述的重组细胞可用于例如病毒分离、疫苗生产和诊断。例如，重组细胞允许分离和/或扩增子代病毒。此外，ha测定通常不用于检测近期人h3n2病毒。重组细胞在这方面可能是有利的，例如扩增病毒。12.此外，具有增加的β?半乳糖苷α2，6唾液酸残基的重组细胞可用作分离的β?半乳糖苷α2，6唾液酸的来源，分离的β?半乳糖苷α2，6唾液酸进而又可用于包被表面(例如珠)，以抑制半乳糖凝集素，以分离或检测接骨木凝集素(sambucus nigra agglutinin，sna)、毛接骨木(sambucus sieboldiana)(ssa)或日本栝蒌凝集素i(trichosanthes japonica agglutinin i，tja?i)。13.在一个实施方案中，提供了修饰在哺乳动物或禽细胞上的细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基和人β?半乳糖苷α2，6唾液酸残基的量的方法。在一个实施方案中，该方法包括：在亲本哺乳动物或禽细胞中使一种或更多种β?半乳糖苷α2，3唾液酸转移酶(st3gal)基因发生突变，并且使人β?半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶(st6gal)基因过表达，以产生经修饰的哺乳动物或禽细胞，所述经修饰的哺乳动物或禽细胞相对于对应的亲本细胞在经修饰的细胞的表面上具有降低量的细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基和提高量的人β?半乳糖苷α2，6唾液酸残基。在一个实施方案中，使用基因组编辑系统，例如crispr/cas9、锌指核酸酶(zinc finger nuclease，zfn)或转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator?like effector nuclease，talen)系统，使一种或更多种st3gal基因发生突变。在一个实施方案中，突变包括一种或更多种st3基因中的一个或更多个核苷酸插入或者一个或更多个核苷酸缺失，或者二者兼有。在一个实施方案中，经修饰的细胞包含含有st6gal开放阅读框的表达盒。在一个实施方案中，经修饰的细胞是肾细胞。在一个实施方案中，经修饰的细胞是犬细胞。14.使用重组细胞的方法包括繁殖流感病毒，例如人流感病毒以用于疫苗生产的方法。在一个实施方案中，流感病毒是甲型流感病毒。在一个实施方案中，流感病毒是乙型流感病毒。在一个实施方案中，流感病毒是h3病毒。在一个实施方案中，病毒是a/h1n1、a/h3n2、b/yamagata谱系乙型流感病毒或b/victoria谱系乙型流感病毒。15.使用重组细胞的另一种方法是分离流感病毒的方法。该方法包括提供来自怀疑感染了流感病毒的禽或哺乳动物的样品；以及使重组细胞与该样品接触。在一个实施方案中，该方法还包括确定样品是否感染了流感病毒。在一个实施方案中，该方法还包括确定病毒的ha和/或na亚型。16.在一个实施方案中，细胞系是经修饰的mdck细胞系，“hck”(代表“人源化mdck”细胞)，其使用crispr/cas介导的基因敲除方法制备以使催化α?2，3连接的唾液酸合成的唾液酸转移酶下调，并使催化α?2，6连接的唾液酸合成的唾液酸转移酶过表达。hck细胞表达低水平的α?2，3连接的唾液酸和高水平的α?2，6连接的唾液酸(与上呼吸道中的人上皮细胞相似)。如本文所公开的，hck细胞允许比ax?4细胞系10至100倍更好地分离h3n2人流感病毒。流感病毒包括人流感病毒的高效分离和扩增有利于疫苗生产(可能支持更好的复制)，例如有利于季节性流行性感冒病毒疫苗生产，因为季节性人流感病毒经常在未经修饰的mdck细胞中并且甚至在在其表面上过表达α?2，6连接的唾液酸(人流感病毒与其高效结合)的mdck(ax?4)细胞中复制效率低下。在一个实施方案中，与在未经修饰的mdck细胞、mdck(ax?4)细胞或mdck?siat1细胞中相比，在本文公开的经修饰的细胞系上人流感病毒的滴度为至少一个log、至少两个log、至少三个log或更高(li et al.，2009)。附图说明17.图1a至1p.hck细胞对人流感病毒生长和分离的敏感性。a至l)季节性流感病毒在mdck、ax?4和hck细胞中的生长动力学。mdck、ax4和hck细胞用病毒以0.002的感染复数(multiplicity of infection，moi)进行感染。在指定时间收获受感染细胞的上清液，并在hck细胞中通过噬斑测定来确定病毒滴度。误差棒指示来自三个独立实验的标准偏差。通过使用在方法部分中描述的线性混合模型来计算p值(*p＜0.05；**p＜0.01)。红色和蓝色星号指示hck和ax4细胞与mdck细胞的比较；灰色星号指示以红色和蓝色示出的细胞系之间的比较。m至p)hck与ax4细胞对季节性流感病毒的敏感性比较。制备连续2倍稀释(21至220)的临床样品并接种至ax4和hck细胞中。持续7天观察细胞的细胞病变作用(cytopathic effect，cpe)的发生。用每种病毒稀释物对三个孔进行接种。在所有三个孔中显示出cpe的最高稀释度通过水平棒(horizontal bar)示出。每个水平棒末端的数字指示hck最高稀释度与ax4最高稀释度的比率。18.图2a至2b.表达显著低水平α2，3连接的唾液酸和高水平α2，6连接的唾液酸的mdck细胞的生成示意图。19.图3a至3c.α2，6和α2，3连接的sia的细胞表面表达的流式细胞术分析。将克隆6?11(橙色线开放谱)和亲本mdck细胞(黑色线开放谱)与生物素化山槐ii凝集素(maackiaamurensis ii，mal ii)凝集素(对α2，3连接的唾液酸具有特异性)或接骨木凝集素(sna)凝集素(对α2，6连接的sia具有特异性)，随后是经alexa 488缀合的链霉亲和素一起孵育，并且随后通过流式细胞术进行分析。未染色的细胞作为阴性对照(无凝集素)。20.图4a至4j.表达显著低水平α2，3连接的唾液酸和高水平α2，6连接的唾液酸的mdck细胞的表征。携带七种不同的β?半乳糖苷α2，3唾液酸转移酶(st3gal)基因的突变的mdck细胞通过使用crispr/cas9基因组编辑系统来生成，如在方法部分中所述。经编辑的mdck细胞通过转染包含st6gal?i基因的质粒来进一步修饰以使人β?半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶i(st6gal?i)过表达。经修饰的细胞克隆用嘌呤霉素(puromycin)和杀稻瘟素(blasticidin)进行选择，并且进行表征。a至d)α2，6和α2，3连接的sia的细胞表面表达的流式细胞术分析。将经修饰的mdck细胞(绿色线和红色线开放谱)和亲本mdck细胞(黑色线开放谱)与生物素化山槐ii凝集素(mal ii)凝集素(对α2，3连接的唾液酸具有特异性)或接骨木凝集素(sna)凝集素(对α2，6连接的sia具有特异性)一起孵育，随后与经alexa 488缀合的链霉亲和素一起孵育，并且随后通过流式细胞术进行分析。e至g)α2，3连接的唾液酸表达的免疫荧光分析。将经修饰的mdck和亲本mdck细胞进行固定并用识别siaα2，3galβ1，4glcnac的单克隆抗体(绿色)进行染色。细胞核用hoechst染料(蓝色)进染色。h和g)α2，6连接的sia的细胞表面表达的流式细胞术分析。将经修饰的mdck细胞(红色线开放谱)、亲本mdck细胞(黑色线开放谱)和ax4细胞(蓝色线开放谱)与sna凝集素或毛接骨木(ssa)凝集素(对α2，6连接的sia具有特异性)一起孵育，随后与经alexa 488缀合的链霉亲和素一起孵育，并且随后通过流式细胞术进行分析。i)α2，3连接的sia的细胞表面表达的流式细胞术分析。将经修饰的mdck细胞(红色线开放谱)、亲本mdck细胞(黑色线开放谱)和ax4细胞(蓝色线开放谱)与mal ii凝集素一起孵育，随后与经alexa 488缀合的链霉亲和素一起孵育，并且随后通过流式细胞术进行分析。21.图5a至5f.在ha和na蛋白中氨基酸变化的定位。a至c)示出与人受体类似物复合的a/california/04/2009(h1n1pdm)ha(pdb id：3ubn)、a/wyoming/3/2003(h3n2)ha(pdb id：6bkr)和b/hong kong/8/1973 ha(pdb id：2rfu)的三维结构。在本研究中鉴定的突变以红色显示。在甲型流感病毒ha中的突变以h3编号显示。d至f)示出与奥司他韦羧酸盐(oseltamivir carboxylate)复合的a/california/04/2009(h1n1pdm)na(pdb id：3ti6)、a/tanzania/205/2010(h3n2)na(pdb id：4gzp)和b/brisbane/60/2008 na(pdb id：4cpm)的三维结构。在本研究中鉴定的突变以红色显示。所有突变均以n2编号显示。图像使用ds visualizer v17.2创建。具体实施方式22.定义[0023]“载体”或“构建体”(有时称为基因递送或基因转移“载体”)是指包含待递送至宿主细胞(体外或体内)的多核苷酸的大分子或分子复合物。待递送的多核昔酸可包含目的编码序列，可包含用于将突变引入宿主细胞基因组的序列，或二者兼有。载体包括例如，质粒、病毒载体(例如腺病毒、腺相关病毒(adeno?associated viruse，aav)、慢病毒、疱疹病毒和逆转录病毒)、脂质体和另一些包含脂质的复合物，以及能够介导多核苷酸向宿主细胞递送的另一些大分子复合物。载体还可包含进一步调节基因递送和/或基因表达或者以其他方式为靶细胞提供有益特性的其他组分或功能。这样的其他组分包括例如影响与细胞结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞对载体核酸的摄取的组分；影响摄取之后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂)；以及影响多核苷酸表达的组分。这样的组分还可包括标志物，例如可用于检测或选择已摄取并表达由载体递送的核酸的细胞的可检测和/或选择标志物。这样的组分可作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的组分或功能的某些病毒载体)，或可修饰载体以提供这样的功能。大量这样的载体是本领域已知的并且通常是可获得的。当载体维持在宿主细胞中时，该载体可在有丝分裂期间作为自主结构被细胞稳定地复制、并入宿主细胞的基因组内，或维持在宿主细胞的核或胞质中。[0024]“重组病毒载体”是指包含一个或更多个异源基因或序列的病毒载体。由于许多病毒载体显示出与包装相关的大小限制，因此异源基因或序列通常通过替换病毒基因组的一个或更多个部分来引入。这样的病毒可成为复制缺陷型(生物学上包含的)，需要在病毒复制和衣壳化期间(通过使用例如辅助病毒或携带复制和/或衣壳化所需基因的包装细胞系)以反式方式提供缺失的功能。还描述了其中在病毒颗粒外部携带待递送的多核苷酸的经修饰的病毒载体。[0025]本文中使用的“基因递送”、“基因转移”等术语是指将外源多核苷酸(有时称为“转基因”)引入宿主细胞，不考虑用于引入的方法。这样的方法包括多种公知的技术，例如载体介导的基因转移(通过例如病毒感染/转染，或基于蛋白质或基于脂质的多种其他基因递送复合物)以及促进“裸”多核苷酸递送的技术(例如电穿孔、“基因枪”递送和用于引入多核苷酸的多种其他技术)。引入的多核苷酸可稳定地或暂时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常需要引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者整合到宿主细胞的复制子例如染色体外复制子(例如，质粒)或核或线粒体染色体中。如本领域已知的，已知许多载体能够介导基因向哺乳动物细胞的转移。[0026]“转基因”意指通过人工暂时或永久地插入至细胞中，并且如果整合至基因组中或在染色体外维持则成为生物体的一部分的任何核酸分子段(例如，dna)。这样的转基因可包含与转基因生物体部分或完全异源(即外来)的基因的开放阅读框的至少一部分，或者可代表与生物体的内源基因同源的基因的开放阅读框的至少一部分，该部分任选地编码具有与对应全长多肽基本相同的活性或具体对应全长多肽的至少一种活性的多肽。[0027]“转基因细胞”意指包含转基因的细胞。例如，用包含表达盒的载体稳定或瞬时转化的细胞是可用于产生具有改变的表型特征的细胞群的转基因细胞。“重组细胞”是已被遗传修饰，例如通过遗传改造在非重组细胞中插入、缺失或替换序列的细胞。[0028]术语“野生型”或“天然”是指具有当从天然存在的来源分离的基因或基因产物特征的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，并且因此被任意指定为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“经修饰的”或“突变”是指当与野生型基因或基因产物相比时展示出在序列和或功能特性上的修饰(即改变的特征)的基因或基因产物。需要注意的是，可分离天然存在的突变体；这些突变体是通过当与野生型基因或基因产物相比时其具有改变的特征这一事实来确定的。[0029]术语“转导”表示通过病毒载体例如复制缺陷型病毒载体在体内或体外将多核苷酸递送至接受体细胞。[0030]术语“异源”在其涉及核酸序列，例如编码蛋白质的基因序列和控制序列时表示通常不连接在一起和/或通常与特定细胞不相关的序列，例如，来自不同来源的序列(例如，来自病毒的序列与在未经感染细胞的基因组中的序列异源)。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一核酸分子内或与另一核酸分子连接的核酸区段，其在自然界中未发现与其他分子缔合。例如，核酸构建体的异源区域可包含侧接在自然界中未发现与编码序列相关的序列的编码序列，即异源启动子。异源编码序列的另一个实例是其中在自然界中未发现编码序列自身的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，认为用通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞是异源的。[0031]“dna”意指尤其存在于线性dna分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中的双链或单链形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。在讨论特定dna分子的结构时，在本文中可根据仅给出沿dna非转录链(即，具有与mrna互补的序列的链)的5′至3′方向上的序列的正常惯例来捕述序列。该术语包括包含四种碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶的分子，以及包含本领域已知的碱基类似物的分子。[0032]本文中使用的术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“a?g?t”与序列“t?c?a”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可“完全”或“全部”互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。[0033]据说dna分子具有“5′末端”和“3′末端”，因为单核苷酸以使得一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸与在一个方向上与其相邻的3′氧通过磷酸二酯键连接的方式反应以生成寡核苷酸或多核苷酸。因此，如果寡核苷酸或多核苷酸的5′磷酸未与单核苷酸戊糖环的3′氧连接，则将该寡核苷酸或多核苷酸的末端称为“5′末端”，并且如果寡核苷酸或多核苷酸的3′氧未与随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸连接，则将该寡核苷酸或多核苷酸的末端称为“3′末端”。本文中使用的核酸序列，即使在较大的寡核苷酸或多核苷酸内部，也可以说具有5′末端和3′末端。在线性或环状dna分子中，离散元件被称为“下游”或3′元件的“上游”或5′。该术语反映了转录沿dna链以5′至3′的方式进行的事实。指导连锁基因转录的启动子和增强子元件一般位于编码区的5′或上游。然而，增强子元件即使在位于启动子元件和编码区的3′端时也能发挥其作用。转录终止和聚腺苷酸化信号位于编码区的3′或下游。[0034]在一个实施方案中，“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是当置于合适调控序列的控制下时在体外或体内被转录并且任选地还被翻译成基因产物例如多肽的核酸分子。编码区可以以cdna、基因组dna或rna形式存在。当以dna形式存在时，核酸分子可以是单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子决定。基因可包括但不限于来自原核或真核mrna的cdna、来自原核或真核dna的基因组dna序列，和合成dna序列。转录终止序列将通常位于基因序列的3′。[0035]术语“控制元件”统指启动子区域、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，“ires”)、增强子、剪接点等，其共同提供接受体细胞中的编码序列的复制、转录、转录后加工和翻译。并非所有这些控制元件都需要一直存在，只要选定的编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译即可。[0036]在本文中以其普通意义使用的术语“启动子”是指包含dna调控序列的核苷酸区域，其中所述调控序列来源于能够结合rna聚合酶并启动下游(3′方向)编码序列转录的基因。[0037]“增强子”意指这样的核酸序列：当定位于接近启动子时，其相对于在不存在增强子结构域的情况下由启动子产生的转录活性赋予提高的转录活性。[0038]关于核酸分子的“可操作地连接”意指两个或更多个核酸分子(例如待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以允许核酸分子的转录这样的方式连接。关于肽和/或多肽分子的“可操作地连接”意指两个或更多个肽和/或多肽分子以使得产生具有融合体的每个肽和/或多肽组分的至少一种特性的单多肽链，即融合多肽这样的方式连接。融合多肽可以是嵌合的，即由异源分子构成。[0039]“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽之间的同一性百分比。一个序列与另一个序列之间的对应关系可通过本领域已知的技术来确定。例如，可通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序，通过直接比较两个多肽分子之间的序列信息来确定同源性。或者，可通过多核苷酸在同源区域之间形成稳定双链体的条件下杂交，随后用单链特异性核酸酶消化，并进行消化片段的尺寸确定来确定同源性。如使用上述方法确定的，当至少约80％、至少约90％或至少约95％的核苷酸或氨基酸分别在限定长度的分子上匹配时，两个dna或两个多肽序列彼此是“基本上同源的”。[0040]“哺乳动物”意指哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于以下：人和非人灵长类，例如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，例如牛、羊、猪、山羊和马；驯养的哺乳动物，例如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠、兔和豚鼠等。[0041]“来源于”意指核酸分子由亲本核酸分子制备或设计，该衍生物保留与亲本核酸分子基本相同的功能特征，例如，编码与由从其制备或设计的亲本核酸分子编码的基因产物具有基本相同的活性的基因产物。[0042]“表达构建体”或“表达盒”意指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包含启动子。还可包含另外的元件，例如增强子和/或转录终止信号。[0043]术语“外源的”当与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸相关使用时，是指已通过人工或天然方法引入到细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸。外源核酸可来自不同的生物体或细胞，或者其可以是在生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或更多个另外的拷贝。作为非限制性实例，外源核酸位于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置，或者在其他情况下侧接与存在于自然界中的核酸序列不同的核酸序列。[0044]术语“分离的”当与核酸、肽、多肽、病毒或细胞相关使用时，是指被鉴定并且与通常在其天然来源中与其相关的至少一种污染物核酸、多肽或其他生物组分分离(例如，使其与体内物质不相关，或基本上从体外物质中进行纯化)的核酸序列、肽、多肽、病毒或细胞。分离的核酸、肽、多肽或病毒以不同于其存在于自然界中的形式或环境存在。例如，给定的dna序列(例如，基因)存在于宿主细胞染色体上接近邻近基因；rna序列，例如编码特定蛋白质的特定mrna序列，在细胞中作为与编码多种蛋白质的许多其他mrna的混合物存在。分离的核酸分子可以以单链或双链形式存在。当利用分离的核酸分子来表达蛋白质时，该分子将至少包含有义链或编码链(即，该分子可以是单链)，但其可包含有义链和反义链二者(即，该分子可以是双链)。[0045]本文中使用的术语“重组核酸”或“重组dna序列、分子或区段”是指从来源获得或分离的核酸，例如dna，其随后可在体外进行化学改变并且包括但不限于天然存在的序列、非天然存在的序列，或与未以其在天然基因组中定位的方式定位的天然存在的序列对应的序列。从来源“获得”的dna的一个实例是被确定为可用的片段并且随后以基本上纯的形式化学合成的dna序列。从来源“分离”的这样的dna的一个实例是这样的可用dna序列，其通过化学方法(例如，通过使用限制性内切核酸酶)从所述来源切除或移出，以使其可通过遗传改造的方法进行进一步操作(例如扩增)以使用。[0046]本文中使用的术语“重组蛋白质”或“重组多肽”是指由重组dna分子表达的蛋白质分子。[0047]除非另有区别，否则术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。[0048]术语“序列同源性”意指两个核酸序列之间碱基匹配的比例或两个氨基酸序列之间氨基酸匹配的比例。当序列同源性以百分比，例如50％表示时，该百分比表示与一些其他序列进行比较的所选序列的长度上的匹配比例。允许空位(在两个序列中的任何一个中)最大化匹配；通常使用的空位长度为15个碱基或更少，6个碱基或更少，例如2个碱基或更少。当使用寡核苷酸作为探针或处理时，靶核酸与寡核苷酸序列之间的序列同源性一般为在20个可能的寡核苷酸碱基对匹配中的不少于17个靶碱基匹配(85％)；在10个可能的碱基对匹配中的不少于9个匹配(90％)，或在20个可能的碱基对匹配中的不少于19个匹配(95％)。[0049]一般而言，多核苷酸、寡核苷酸和片段与目的核酸序列之间的核酸序列同源性为至少65％，并且更通常随着y提高同源性为至少约70％、约90％、约95％、约98％和100％。[0050]如果两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，则其是同源的。例如，85％同源性意指当两个序列针对最大匹配进行比对时，85％的氨基酸是相同的。允许空位(在进行匹配的两个序列中的任何一个中)处于最大化匹配，空位长度为5或更小，例如2或更小。或者，两个蛋白质序列(或从其获得的长度为至少30个氨基酸的多肽序列)是同源的，如本文中使用该术语一样，如果使用具有突变数据矩阵的程序align和6或更大的空位罚分，其比对评分大于5(以标准偏差为单位)的话。当使用align程序进行最佳比对时，如果两个序列或其部分的氨基酸大于或等于50％相同，则可认为这两个序列或其部分是同源的。[0051]术语“与......对应”在本文中用于意指多核苷酸序列与编码多肽或其互补物的参考多核苷酸序列的全部或一部分同源(例如相同，不严格地在进化上相关)，或者多肽序列在序列或功能上与参考多肽序列相同。为了举例说明，核苷酸序列“tatac”与参考序列“tatac”对应并且与参考序列“gtata”互补。[0052]以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸之间的序列关系：“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“显著同一性”。“参考序列”是用作序列比较基础的确定序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如作为在序列表中给出的全长cdna或基因序列的区段，或者可包含完整的cdna或基因序列。一般而言，参考序列的长度为至少20个核苷酸，经常地长度为至少25个核苷酸，并且通常长度为至少50个核苷酸。由于两个多核苷酸可各自(1)包含两个多核苷酸之间相似的序列(即完整多核苷酸序列的一部分)，并且(2)可还包含两个多核苷酸之间不同的序列，因此两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以确定和比较局部区域的序列相似性来进行。[0053]本文中使用的“比较窗口”是指至少20个连续核苷酸的概念性区段，并且其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包含20％或更少的添加或缺失(即，空位)，以用于两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可通过使用局部同源性算法或通过检索相似方法，通过这些算法的计算机化实施(gap、bestfit、fasta和tfasta遗传学软件包或通过检查来进行，并且选择通过多种方法生成的最佳比对(即，在比较窗口上产生最高的同源性百分比)。[0054]术语“序列同一性”意指两个多核苷酸序列在比较窗口上是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”意指两个多核苷酸序列在比较窗口上是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”是通过以下计算的：在比较窗口上比较两个最佳比对序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，a、t、c、g、u或i)的位置数目以得到匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(即，窗口尺寸)，并且将结果乘以100，以得到序列同一性百分比。本文中使用的术语“显著同一性”表示多核苷酸序列的特征，其中所述多核苷酸包含的序列在至少20个核苷酸位置的比较窗口上，经常地在至少20至50个核苷酸的窗口上与参考序列相比具有至少85％序列同一性、至少90％至95％序列同一性、更通常地至少99％序列同一性，其中序列同一性百分比是通过将参考序列与多核苷酸序列进行比较来计算的，所述多核苷酸序列在比较窗口上可包含总共占参考序列20％或更少的缺失或添加。[0055]当应用于多肽时，术语“显著同一性”意指两个肽序列当例如通过程序gap或bestfit使用缺省空位权重进行最佳比对时，共有至少约80％的序列同一性，至少约90％的序列同一性、至少约95％的序列同一性和或至少约99％的序列同一性。[0056]本文中使用的“基本上纯”意指目标物质是存在的主要物质(即，以摩尔为基础，其比组合物中的任何其他单独物质更丰富)，并且基本上纯化的部分是其中目标物质包含存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔为基础)的组合物。一般而言，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的所有大分子物质的大于约80％、大于约85％、约90％、约95％和约99％。可将目标物质纯化至基本同质(通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。[0057]“经转染的”、“经转化的”或“转基因的”在本文中用于包括已被至少一种重组dna序列的存在而改变或增加的任何宿主细胞或细胞系。本发明的宿主细胞通常通过用在质粒表达载体中的dna序列作为分离的线性dna序列进行转染或用重组病毒载体进行感染来产生。[0058]示例性细胞及其修饰[0059]大多数流感疫苗是在鸡胚(embryonated chicken egg)中产生的，但越来越多的流感疫苗是在其他系统中产生的。mdck(马丁?达比犬肾)细胞是已批准用于流感疫苗生产的两种哺乳动物细胞系之一。细胞中病毒的产生可通过改变宿主细胞或病毒来增强。然而，对于疫苗生产，传代期间的病毒修饰并不有利。[0060]如本文所公开的，可修饰细胞例如禽细胞或哺乳动物细胞(包括但不限于犬、猫、马、牛、山羊、猪、人或非人灵长类细胞)的基因组，以增强流感病毒的分离、繁殖或二者。例如，由于ha的细胞表面受体的数目或组成，某些ha亚型(ha亚型h1至h18)可能不与某些物种或类型的细胞很好地结合。这些细胞可通过提高细胞表面受体的数目或修饰存在于细胞表面受体上的分子的类型，或二者来进行修饰。例如，在哺乳动物中有约20种唾液酸转移酶将唾液酸残基转移至糖缀合物的寡糖侧链上。编码那些酶中的一种或更多种的基因可被修饰以降低(例如降低1％、5％、10％、50％、70％、80％、90％或更多)或消除所编码酶的表达，或者那些酶中的一种或更多种的开放阅读框可在细胞中从外源引入的表达盒，例如具有该表达盒的质粒表达。例如，α2，6唾液酸转移酶将具有α2，6键的唾液酸转移至末端gal(st6gali和ii)或galnac(st6galnaci至vi)处；α2，8唾液酸转移酶将具有α2，8键的唾液酸(stsiai至iv)进行转移；并且α2，3唾液酸转移酶将具有α2，3键的唾液酸转移至末端gal残基(st3gal)处。st3gali至ii和iv转移至位于末端galβ1?3glcnac上的gal残基处，st3galiv和vi转移至位于末端galβ1?4glcnac上的gal残基处，st3galv转移至位于末端galβ1?4glc?cer上的gal残基处，并且st3galiii转移至位于末端galβ1?3glcnac或galβ1?3glcnac上的gal残基处。因此，这些唾液酸转移酶的每种基因可用于制备本文公开的细胞。在一个实施方案中，将在宿主细胞基因组中的一种或更多种α2，3唾液酸转移酶基因进行修饰以降低例如消除所编码酶的表达，并且将一种或更多种α2，6唾液酸转移酶基因从引入宿主细胞的重组表达载体表达。为了降低唾液酸转移酶的表达，可将一种或更多种载体或载体与分离的蛋白质的组合引入细胞中。载体和/或蛋白质可以是可靶向细胞中特定基因的重组酶系统的一部分，系统包括crispr/cas、talen和锌指核酸酶。[0061]为了制备用于本文转化的表达盒(以表达rna，例如grna或包括重组酶或唾液酸转移酶的蛋白质)，重组dna序列或区段可以是环状或线性、双链或单链的。编码与编码目的基因产物的mrna序列基本上互补的rna序列的dna序列通常是在相反方向上(即，3′至5′而不是5′至3′)克隆至盒中的“有义”dna序列。一般而言，dna序列或区段是嵌合dna的形式，例如质粒dna，其也可包含侧接促进dna在细胞中表达的控制序列的编码区。本文中使用的“嵌合”意指载体包含来自至少两个不同物种的dna，或包含来自相同物种的dna，其以在物种的“天然”或野生型中不存在的方式连接或缔合。[0062]除了用作转录单位的dna序列或其部分之外，dna的一部分可以是未转录的，起到调节或结构功能的作用。例如，dna本身可包含在真核细胞例如哺乳动物细胞或在某些细胞类型中有活性的启动子，或者可利用已存在于为嗜淋巴细胞病毒的转化靶标的基因组中的启动子。这样的启动子包括cmv启动子，以及sv40晚期启动子和逆转录病毒ltr(长末端重复元件)，例如mmtv、rsv、mlv或hiv ltr，但是可使用本领域公知的许多其他启动子元件。[0063]在宿主细胞中发挥作用的其他元件，例如内含子、增强子、聚腺苷酸化序列等，也可以是重组dna的一部分。这样的元件对于dna的功能可以是或可以不是必需的，但其可通过影响转录、mrna的稳定性等来提供改进的dna表达。这样的元件可根据期望包含在dna中以获得在细胞中转化dna的最佳性能。[0064]待引入细胞中的重组dna可包含选择标记基因或报道基因或二者，以促进从试图转化的细胞群中鉴定和选择转化细胞。或者，选择标记可携带在单独的dna片段上，并用于共转化程序中。选择标记和报道基因二者均可在侧翼具有合适的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。可用的选择标记是本领域公知的并且包括例如抗生素和除草剂抗性基因，例如neo、hpt、dhfr、bar、aroa、puro、hyg、dapa等。另见在lundquist et al.(美国专利no.5,848,956)的表1中列出的基因。[0065]报道基因用于鉴定潜在的转化细胞和用于评价调节序列的功能性。编码可易于测定的蛋白质的报道基因是本领域公知的。一般而言，报道基因是这样的基因，该基因不存在于接受体生物体或组织中或者不由其表达，并且该基因编码其表达通过一些可易于检测的特性，例如酶活性来体现的蛋白质。示例性报告基因包括来自大肠杆菌(e.coli)的tn9的氯霉素乙酰转移酶基因(cat)，大肠杆菌的uida基因座的β?葡糖醛酸酶基因(gus)，绿色、红色或蓝色荧光蛋白基因以及萤光素酶基因。报道基因的表达在将dna引入接受体细胞中之后的合适时间进行测定。[0066]用于构建可转化靶细胞的重组dna的一般方法是本领域技术人员公知的，并且相同的组合物和构建方法可用于产生本文中可用的dna。例如sambrook et al.，molecular cloning：a laboratory manual(2002)提供了合适的构建方法。[0067]重组dna可通过以下容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞中：用包含重组dna的表达载体通过任何可用于引入特定细胞的程序(例如物理或生物学方法)进行转染，以产生具有重组dna的转化(转基因)细胞，以使宿主细胞表达目的dna序列。在一个实施方案中，引入细胞中的重组dna中的至少一种在染色体外维持。在一个实施方案中，至少一种重组dna稳定整合至宿主细胞基因组中。[0068]将重组dna引入宿主细胞中的物理方法包括钙介导的方法、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。将目的dna引入宿主细胞中的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，已成为广泛使用的用于将基因插入真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞中的方法。可用于将基因引入细胞中的其他病毒载体可来源于痘病毒，例如牛痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒等。[0069]为了确认宿主细胞中重组dna序列的存在，可进行多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的分子生物学测定，例如southern和northern印迹、rt?pcr和pcr；生化测定，例如如通过免疫学方法(elisa和western印迹)或通过其他分子测定来检测特定基因产物的存在或不存在。[0070]为了检测和定量从引入的重组dna区段产生的rna，可使用rt?pcr。在这种pcr应用中，首先需要使用酶例如逆转录酶将rna逆转录为dna，并且随后通过使用常规pcr技术来扩增dna。在大多数情况下，pcr技术虽然可用，但不能证明rna产物的完整性。关于rna产物性质的另外的信息可通过northern印迹来获得。该技术证明了rna种类的存在，并且提供了关于该rna完整性的信息。也可使用点印迹或槽印迹northern杂交来确定rna种类的存在或不存在。这些技术是对northern印迹的修改，并且仅证明rna种类的存在或不存在。[0071]虽然southern印迹和pcr可用于检测所讨论的重组dna区段，但其不提供关于重组dna区段是否被表达的信息。表达可通过特异性鉴定引入的dna序列的肽产物或者评价由引入的dna区段在宿主细胞中的表达引起的表型变化来评价。[0072]对于用于敲低或敲除一种或更多种唾液酸转移酶的表达的载体，该载体包含导致细胞基因组中一种或更多种突变的序列。该突变有效抑制或阻止至少一种功能性唾液酸转移酶的产生。在一个实施方案中，突变是来自1、10、20、50、100、500和多至数千个核苷酸的缺失，例如与唾液酸转移酶基因对应的序列的1％、10％、50％、90％或更多缺失，例如在唾液酸转移酶(例如2，3唾液酸转移酶(st3))的编码区中的缺失。在一个实施方案中，缺失的序列与以下序列对应：其与seq id no.5、7、9、11、13、15或17或其任意组合具有显著同一性，例如至少80％或更多，例如85％、90％或95％和多至100％或者在中间的任何整数的核酸序列同一性。在一个实施方案中，突变是来自1、2、3、5、10、20、50、100、500和多至数千个核苷酸或更多核苷酸插入至与唾液酸转移酶基因对应的序列中，例如插入至唾液酸转移酶(例如2，3唾液酸转移酶(st3))的编码区中。在一个实施方案中，插入在与以下序列对应的序列中：其与seq id no.5、7、9、11、13、15或17或其任意组合具有显著同一性，例如至少80％或更多，例如85％、90％或95％和多至100％或者在中间的任何整数的核酸序列同一性。在一个实施方案中，突变包括在与唾液酸转移酶(例如2，3唾液酸转移酶(st3))编码区对应的序列中的一个或更多个核苷酸替换，例如1、2、3、4、5、6、10或多至数百个核苷酸替换，例如在seq id no.5、7、9、11、13、15或17或其任意组合中的替换。在一个实施方案中，在宿主细胞中存在与seq id no.5、7、9、11、13、15或17或其任意组合具有显著同一性，例如至少80％或更多，例如85％、90％或95％和多至100％或者在中间的任何整数的核酸序列同一性的序列中的插入、核苷酸替换和/或缺失的组合。在一个实施方案中，突变导致宿主细胞的一种或更多种st3基因的表达降低，所述st3基因例如编码与seq id no.6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少80％或更多，例如85％、90％或95％和多至100％或者在中间的任何整数的氨基酸序列同一性的蛋白质的基因。[0073]在一个实施方案中，宿主细胞表达一种或更多种st6基因，例如编码与seq id no.1至4中的任一个具有至少80％或更多，例如85％、90％或95％和多至100％或者在中间的任何整数的氨基酸序列同一性的蛋白质的基因。[0074]crispr/cas系统[0075]ii型crispr是良好表征的系统，其以四个连续步骤进行靶向dna双链断裂。第一，从crispr基因座转录两个非编码rna，前crrna(pre?crrna)阵列和tracrrna。第二，tracrrna与前crrna的重复区域杂交并介导前crrna加工为包含单独间隔序列的成熟crrna。第三，成熟的crrna：tracrrna复合物通过crrna上的间隔区与靶dna上接近前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，pam)的前间区序列之间的沃森?克里克(watson?crick)碱基配对将cas9引导至靶dna，这是靶标识别的另外的要求。最后，cas9介导靶dna的切割以在前间区序列内产生双链断裂。crispr/cas系统的活动包括三个步骤：(i)在称为“适应”的过程中将外来dna序列插入crispr阵列以防止未来攻击，(ii)相关蛋白质的表达，以及阵列的表达和加工，随后是(iii)rna介导的对外来核酸的干扰。因此，在细菌细胞中，数种所谓的“cas”蛋白涉及crispr/cas系统的天然功能。crispr基因座的初级产物显示为包含入侵者靶向序列的短rna，并称为指导rna。[0076]“cas1”多肽是指crispr相关(crispr associated，cas)蛋白1。cas1(蛋白质分类系统的直系同源聚类中的cog1518)是crispr相关系统(crispr?associated system，cass)的最佳标志物。基于系统发育比较，已鉴定了crispr相关免疫系统的七个不同版本(cass1至7)。用于本文所述方法的cas1多肽可以是任何原核生物中存在的任何cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是古菌(archaeal)微生物的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是广古菌门(euryarchaeota)微生物的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是泉古菌门(crenarchaeota)微生物的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是细菌的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是超嗜热菌(aquifex aeolicus)的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是作为cas1至7之一的成员的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是作为cass3成员的cas1多肽。在某些实施方案中，cas1多肽是作为cass7成员的cas1多肽。[0077]在某些实施方案中，cas1多肽是作为cass3或cass7成员的cas1多肽。[0078]在一些实施方案中，cas1多肽由以下编码：在基因库(genbank)中提供的例如geneid编号为2781520、1006874、9001811、947228、3169280、2650014、1175302、3993120、4380485、906625、3165126、905808、1454460、1445886、1485099、4274010、888506、3169526、997745、897836或1193018的核苷酸序列，和/或显示与由这些多核苷酸编码并且其多肽作为cas1多肽发挥作用的氨基酸具有同源性(例如，大于80％，90％至99％包括91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列。[0079]有三种类型的crispr/cas系统，其均包含rna和cas蛋白。i型和iii型二者均具有加工前crrna的cas内切核酸酶，所述前crrna当完全加工为crrna时组装能够切割与crrna互补的核酸的多cas蛋白复合物。[0080]在ii型crispr/cas系统中，crrna是使用不同机制产生的，其中反式激活rna(tracrrna)与前crrna中的重复序列互补，在存在cas9蛋白的情况下通过双链特异性rna酶iii触发加工。随后cas9能够切割与成熟crrna互补的靶dna，然而通过cas9的切割取决于crrna与靶dna之间的碱基配对和crrna中称为pam序列的短基序(前间区序列邻近基序)的存在二者。另外，tracrrna也必须存在，因为其在其3′末端与crrna进行碱基配对，并且这种关联会触发cas9活性。[0081]cas9蛋白具有至少两个核酸酶结构域：一个核酸酶结构域类似于hnh核酸内切酶，而另一个类似于ruv核酸内切酶结构域。hnh型结构域显示出负责切割与crrna互补的dna链，而ruv结构域切割非互补链。[0082]对crrna?tracrrna复合物的需求可通过使用经改造的“单指导rna”(single?guide rna，sgrna)来避免，该sgrna包含通常由crrna和tracrrna退火形成的发夹(参见jinek，et al.(2012)science 337：816和cong et al.(2013)sciencexpress/10.1126/science.1231143)。在s.pyrogenes中，当在cas缔合的rna与靶dna之间形成双链rna：dna异二聚体时，经改造的tracrrna：crrna融合，或sgrna引导cas9切割靶dna。该系统包含cas9蛋白和经改造的sgrna[0083]“cas多肽”包括全长cas多肽、cas多肽的酶促活性片段和cas多肽或其片段的酶促活性衍生物。cas多肽或其片段的合适的衍生物包括但不限于cas蛋白或其片段的突变体、融合体、共价修饰体。[0084]crispr/cas的rna细分[0085]cas9相关的crispr/cas系统包含两个rna非编码组分：tracrrna和前crrna阵列，其包含由相同的同向重复序列(direct repeat，dr)间隔开的核酸酶引导序列(间隔区)。为了使用crispr/cas系统完成基因组改造，这些rna的两种功能都必须存在(参见cong，et al.(2013)sciencexpress1/10.1126/science 1231143)。在一些实施方案中，tracrrna和前crrna通过单独的表达构建体或作为单独的rna提供。在另一些实施方案中，构建嵌合rna，其中经改造的成熟crrna(赋予靶标特异性)与tracrrna(提供与cas9的相互作用)融合以产生嵌合cr?rna?tracrrna杂交体(也称为单指导rna)。(参见jinek，同上和cong，同上)。[0086]可将嵌合体或sgrna改造为包含与任何期望的靶标互补的序列。rna包含与靶标互补并且形式为g[n19]的22个碱基，随后是ngg形式的前间区序列邻近基序(pam)。因此，在一种方法中，sgrna可通过在目的基因中利用已知的zfn靶标通过以下来设计：(i)将zfn异二聚体的识别序列与相关基因组(人、小鼠或特定的植物物种)的参考序列进行比对；(ii)确定zfn半位点之间的间隔区；(iii)确定最靠近间隔区的基序g[n20]gg的位置(当多于一个这样的基序与间隔区重叠时，选择相对于间隔区居中的基序)；(iv)使用该基序作为sgrna的核心。该方法有利地依赖于经证实的核酸酶靶标。或者，可将sgrna简单地通过确定符合式g[n20]gg的合适的靶序列而设计为靶向任何目的区域。[0087]供体[0088]如上所述，插入外源序列(也称为“供体序列”或“供体”或“转基因”或“目的基因”)，例如用于校正突变基因或用于提高野生型基因的表达。显而易见的是，供体序列通常与其所在的基因组序列不同。供体序列可包含侧接两个同源区域以允许在目的位置进行高效的hdr的非同源序列。或者，供体可不具有与dna中的靶位置同源的区域，并且可在靶位点通过nhej依赖性末端连接进行整合，随后进行切割。另外，供体序列可包含含有与细胞染色质中的目的区域不同源的序列的载体分子。供体分子可包含数个与细胞染色质同源的不连续区域。例如，对于通常不存在于目的区域中的序列的靶向插入，所述序列可存在于供体核酸分子中并且侧接与目的区域中的序列同源的区域。[0089]供体多核苷酸可以是单链和/或双链的dna或rna，并且可以以线性或环状形式引入至细胞中。如果以线性形式引入，则供体序列的末端可通过本领域技术人员已知的方法来保护(例如，免于核酸外切降解)。例如，将一个或更多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3′末端，和/或将自互补寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见，例如，chang，et al.(1987)proc.natl.acad.sci.usa 84：4959?4963；nehls，et al.(1996)science 272：886?889。用于保护外源多核苷酸免于降解的另外的方法包括但不限于添加末端氨基以及使用经修饰的核苷酸间键，例如如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、和o?甲基核糖或脱氧核糖残基。[0090]可将多核苷酸作为载体分子的部分引入细胞中，该载体分子具有另外的序列，例如如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体多核苷酸可作为裸核酸引入，作为与试剂例如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸引入，或可通过病毒(例如，腺病毒、aav、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷慢病毒(integrase defective lentivirus，idlv))递送。[0091]通常插入供体以使得其表达由在整合位点的内源启动子，即驱动供体所插入的内源基因的表达的启动子(例如，高表达的白蛋白、aavs1、hprt等)驱动。然而，显然供体可包含启动子和/或增强子，例如组成型启动子或者诱导型或组织特异性启动子。[0092]可将供体分子插入内源基因中，以使得所有、一些或无内源基因表达。例如，可将如本文所述的转基因插入白蛋白或其他基因座中，以使得一些(编码溶酶体酶的转基因的n末端和/或c末端)或无内源性白蛋白序列表达，例如作为与编码溶酶体序列的转基因的融合体。在另一些实施方案中，将转基因(例如，具有或不具有另外的例如针对白蛋白的编码序列)整合至任何内源基因座中，例如安全港基因座(safe?harbor locus)。参见，例如，美国专利公开no.2008/0299580、2008/0159996和2010/0218264。[0093]当内源序列(内源性或转基因的部分)与转基因一起表达时，内源序列(例如白蛋白等)可以是全长序列(野生型或突变体)或部分序列。在一个实施方案中，内源序列是功能性的。这些全长或部分序列(例如，白蛋白)的功能的一些非限制性实例包括提高由转基因(例如，治疗基因)表达的多肽的血清半衰期和/或充当载体。[0094]此外，虽然不是表达所必需的，但外源序列还可包含转录或翻译调节序列，例如，启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2a肽的序列和/或聚腺苷酸化信号。[0095]可利用另一些核酸酶，例如锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)或对靶基因具有特异性的其他核酸酶并且以使得转基因构建体通过同源定向修复(hdr)或在非同源末端连接(nhej)驱动过程期间通过末端捕获来插入。[0096]示例性实施方案[0097]在一个实施方案中，提供了分离的重组哺乳动物或禽细胞，其相对于对应的非重组哺乳动物或禽细胞包含降低量的细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基和提高量的人β?半乳糖苷α2，6唾液酸残基。在一个实施方案中，分离的重组细胞是非人细胞。在一个实施方案中，分离的重组细胞是犬或灵长类细胞。在一个实施方案中，分离的重组细胞包含编码人β?半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶i(st6gal?i)或st6gal?ii的表达盒。在一个实施方案中，st6gal?i或st6gal?ii包含与seq id no.1至4或101中的任一个具有至少80％氨基酸序列同一性的蛋白质。在一个实施方案中，在重组细胞中一种或更多种β?半乳糖苷α2，3唾液酸转移酶基因发生突变以降低细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基的量。在一个实施方案中，在重组细胞中st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gal?iv、st3gal?v、st3gal?vi或st3gal?ii样基因中的两种或更多种发生突变。在一个实施方案中，st3基因与seq id no.5、7、9、11、13、15或17中的任一个具有至少80％的核酸序列同一性。在一个实施方案中，细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基的降低是一种或更多种st3唾液酸转移酶表达降低的结果。在一个实施方案中，一种或更多种st3唾液酸转移酶与seq id no.6、8、10、12、14、16或18中的任一个具有至少80％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，相对于非重组细胞，h3流感病毒在重组细胞中更高效地复制。[0098]在一个实施方案中，提供了分离的重组哺乳动物或禽细胞，其相对于对应的非重组哺乳动物或禽细胞包含降低量的细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基。在一个实施方案中，在重组细胞中st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gal?iv、st3gal?v、st3gal?vi或st3gal?ii样基因中的一种或更多种发生突变。在一个实施方案中，在重组细胞中st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gal?iv、st3gal?v、st3gal?vi或st3gal?ii样基因中的组合发生突变。在一个实施方案中，st3gal?i、st3gal?ii、st3gal?iii、st3gal?iv、st3gal?v、st3gal?vi和st3gal?ii样基因发生突变。[0099]在一个实施方案中，提供了修饰在哺乳动物或禽细胞上的细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基和人β?半乳糖苷α2，6唾液酸残基的量的方法。在一个实施方案中，该方法包括在亲本哺乳动物或禽细胞中使一种或更多种β?半乳糖苷α2，3唾液酸转移酶(st3gal)基因发生突变，并且使人β?半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶(st6gal)基因过表达，以产生经修饰的哺乳动物或禽细胞，所述经修饰的哺乳动物或禽细胞相对于对应的亲本细胞在经修饰的细胞的表面上具有降低量的细胞表面β?半乳糖苷α2，3唾液酸残基和提高量的人β?半乳糖苷α2，6唾液酸残基。在一个实施方案中，使用基因组编辑系统使一种或更多种st3gal基因发生突变。在一个实施方案中，基因组编辑系统包含crispr/cas9、锌指核酸酶(zfn)或转录激活因子样效应物核酸酶(talen)。在一个实施方案中，突变包括在一种或更多种st3基因中的一个或更多个核苷酸插入或者一个或更多个核苷酸缺失，或者二者兼有。在一个实施方案中，经修饰的细胞包含含有st6gal开放阅读框的表达盒。在一个实施方案中，经修饰的细胞是肾细胞。在一个实施方案中，经修饰的细胞是犬细胞。在一个实施方案中，经修饰的细胞是马丁?达比犬肾(mdck)细胞。[0100]在一个实施方案中，提供了繁殖流感病毒的方法。该方法包括用流感病毒感染重组细胞；以及收集子代病毒。在一个实施方案中，流感病毒是人流感病毒。在一个实施方案中，流感病毒是甲型流感病毒。在一个实施方案中，流感病毒是乙型流感病毒。在一个实施方案中，流感病毒是h3病毒。在一个实施方案中，病毒是a/h1n1、a/h3n2、b/yamagata谱系乙型流感病毒或b/victoria谱系乙型流感病毒。[0101]在一个实施方案中，提供了分离流感病毒的方法，其包括提供来自怀疑感染了流感病毒的禽或哺乳动物的样品；以及使重组细胞与样品接触。在一个实施方案中，该方法包括确定样品是否感染了流感病毒。在一个实施方案中，该方法包括确定病毒的ha和/或na亚型。[0102]在一个实施方案中，提供了诊断流感病毒感染的方法。该方法包括使重组细胞与来自怀疑感染了流感病毒的禽或哺乳动物的样品接触；以及确定细胞是否感染了病毒。在一个实施方案中，使用噬斑测定来确定存在的病毒量。在一个实施方案中，使用核酸扩增测定来确定例如在受感染细胞的上清液中存在的病毒量。[0103]示例性唾液酸转移酶序列[0104]在高等脊椎动物中的唾液酸转移酶是糖基转移酶，其介导唾液酸残基从活化的糖供体(cmp?β?neu5ac、cmp?β?neu5gc和cmp?β?kdn)转移至糖蛋白和糖脂的寡糖链的末端非还原位置。根据形成的糖苷键和使用的单糖受体，脊椎动物唾液酸转移酶超家族分为四个家族，st6gal、st3gal、st6galnac和st8sia。哺乳动物和禽st6gal家族的成员催化唾液酸残基转移至2型二糖(gal(nac)β1，4glcnac)的末端半乳糖残基，导致形成α2?6糖苷键。与其他唾液酸转移酶家族不同，该家族包含人基因组中的仅两个旁系同源物，分别命名为st6gal1和st6gal2。人st6gal1基因在广泛多种组织中泛表达，而st6gal2基因以组织特异性(成人脑)和阶段特异性(胚胎)方式表达。哺乳动物st6gall基因表达受控制编码同一多肽酶的数种转录本表达的多个启动子调控。[0105]在一个实施方案中，对在禽或哺乳动物细胞，例如犬或非人灵长类细胞中的一种或更多种st3基因进行修饰以导致在细胞表面上α?2，3连接的唾液酸的表达降低。在一个实施方案中，将一种或更多种人st6基因引入犬或非人灵长类细胞。在一个实施方案中，在将一种或更多种st6基因引入细胞之前，对一种或更多种st3基因进行修饰。在一个实施方案中，在细胞中对st3基因进行修饰之前引入一种或更多种st6基因。在一个实施方案中，同时或顺序地对st3基因进行修饰并将st6基因引入细胞。[0106]在一个实施方案中，表达的st6gal包含：[0107]人st6(登记号kj897554)，其包含：[0108][0109]其由以下编码：[0110][0111]人st6(登录号 bac24793)，其包含：[0112][0113]人st6(登录号 sjl87798)，其包含：[0114][0115]或者[0116]人st6 gal?ii：[0117][0118]人st6gal1，其由以下编码：[0119][0120]人st6gal1，其包含：[0121][0122]或者与seq id no.1至4、101或150中任一个具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质，或者与seq id no.100或151中任一个具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。[0123]在一个实施方案中，突变的st3基因与包含以下的犬st3gali具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性：[0124]xm_022426722)；[0127]st3基因，其编码与以下具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质：[0128][0129](seq id no：6；登录号 xp_022282430)；st3基因，其与包含以下的犬st3galii基因具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性：[0130][0131](登录号 xm_014114023)；[0132]st3基因，其编码与以下具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质：[0133][0133](登录号 xp_013969498)；[0134]st3基因，其与包含以下的犬st3galiii基因具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性：[0135][0135](登录号 xm_025420404)；[0136]st3基因，其编码与以下具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质：[0137][0137](登录号 xp_025276189)；[0138]st3基因，其与包含以下的犬st3galiv基因具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性：[0139][0139](登录号 xm_014113293)；[0140]st3基因，其编码与以下具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质：[0141][0141](登录号 xp_013968768)；[0142]st3基因，其与包含以下的犬galv具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性：[0143][0143](登录号 xm_022404744)；[0144]st3基因，其编码与以下具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质：[0145][0145](登录号 xp_022260452)；[0146]st3基因，其与包含以下的犬galvi具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性：[0147][0148](登录号 xm_005639375)；[0149]st3基因4，其编码与以下具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质：[0150][0150]（登录号 xp_005639432)；[0151]st3基因，其与包含以下的犬st3galii样具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性：[0152](登录号 xm_025469036)；或者[0153]st3基因，其编码与以下具有至少80％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的蛋白质：[0154][0154](登录号 xp_025324821)。[0155]将通过以下非限制性实施例对本发明进行进一步描述。[0156]实施例[0157]方法[0158]细胞。将mdck和ax4细胞维持在包含5％新生小牛血清(newborn calf serum，ncs)或10％胎牛血清(fetal calf serum，fcs)的eagle最小必需培养基(minimal essential media，mem)中。所有细胞在37℃和5％co2下孵育，并且使用pcr定期检测支原体污染并确认无支原体。[0159]临床样本。呼吸道样本从在2017至2018年流感季节期间访问日本横滨市诊所的有流感样症状的患者获得，并提交给横滨市公共卫生研究所(yokohama city institute of public health)用于病毒分离。这些临床样本是在日本国家感染性疾病流行病学监测(national epidemiological surveillance of infectious diseases)计划下收集的。呼吸道样本还从在2013至2014、2015至2016、2016至2017和2017至2018年季节期间访问日本东京诊所的有流感样症状的患者获得，并提交给东京大学医学科学研究所微生物学和免疫学系病毒学部(division of virology，department of microbiology and immunology，institute of medical science，the university of tokyo)用于病毒分离。这些样本是在获得知情同意之后由主治医师收集的。我们的研究方案由东京大学医学科学研究所的研究伦理审查委员会(research ethics review committee)批准(批准号：26?42?0822)。在本研究中使用了通过实时rt?pcr(见下文)或快速诊断试剂盒呈阳性的样品。[0160]病毒。人流感病毒在包含1ug的l?1?甲苯磺酰胺?2?苯乙基氯甲基酮(tpck)?胰蛋白酶/ml的mem中的hck细胞中繁殖。[0161]实时rt?pcr。通过使用简单rna组织试剂盒(promega)或rneasy迷你试剂盒(qiagen)从临床样本中提取rna。使用applied biosystems 7900ht快速实时pcr系统(applied biosystems)或steponeplus实时pcr系统(applied biosystems)，通过实时pcr进行扩增和检测。使用quantitect多重rt?pcr试剂盒(qiagen)或quantitect探针rt?pcr试剂盒(qiagen)进行rt?pcr。探针包含在5′末端具有6?羧基荧光素(fam)或六氯?6?羧基荧光素(hex)报道染料以及在3′末端具有黑洞淬灭剂?1(black hole quencher?1，bhq?1)或6?羧基四甲基罗丹明(tamra)淬灭剂染料的寡核苷酸。使用的引物和探针的列表在表5中提供。[0162]病毒分离。对培养在12孔板中的mdck、ax4和hck细胞接种0.2ml/孔临床样品，并在34℃下孵育至少30分钟。然后将一微升包含2.5μg/ml乙酰化胰蛋白酶的mem添加至细胞中。然后将培养物孵育长至7天，直到有明显的cpe。收获细胞培养上清液并使用豚鼠红细胞进行血细胞凝集测定(见下文)。[0163]血细胞凝集测定。将病毒(50μl)在微量滴定板中用50μl的pbs进行连续稀释。向每个孔添加等体积(即50μl)的0.75％(体积/体积)豚鼠红细胞悬液。将板保持在4℃下，并在孵育90分钟之后评估血细胞凝集。[0164]rt?pcr和病毒基因测序。使用qiaamp病毒rna迷你试剂盒(qiagen)从140ul培养物上清液中提取病毒rna。使用superscript iii一步法rt?pcr系统与platinum taq高保真dna聚合酶(invitrogen)和ha或na基因的特异性引物来扩增样品。然后在tris缓冲液中通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来分析pcr产物，并通过用gelred(biotium)染色来使靶条带显现。将pcr产物进行纯化并进行直接测序。根据在测序色谱上每个位置处的波的高度检查突变频率的水平。少数群体的检出限为10％至20％。使用的引物列表在表5中提供。[0165]人流感病毒的连续传代。在mem中制备病毒的10倍连续稀释液(101至106)。将每种稀释液接种至24孔培养板中的mdck、ax4和hck细胞单层中，每种稀释液使用一个孔。将板在33℃下孵育3天。终点被视为显示出cpe的样品的最高稀释度。从用比终点稀释液高10倍浓度的稀释液接种的孔中收获培养物上清液，并用于下一轮感染。对在第一次和第六次传代之后在每种细胞的上清液中取样的病毒进行序列分析。[0166]统计分析。数据表示为平均值±sd。对于生长曲线数据的分析，我们进行了线性混合效应分析。作为固定效应，使用了不同的细胞系和测量时间(在这些固定效应之间具有相互作用项)。作为随机效应，使用了针对单独动物的截距。将病毒滴度值转换为log10标度，并且使用了r统计包(www.r?project.org)、lme4(bates et al.，2015)和lsmeans包(lenth，2016)用于组比较。使用holm方法调整p值，并且如果p值小于0.05，则认为是显著的。[0167]表达显著低水平α2，3连接的唾液酸和高水平α2，6连接的唾液酸的mdck细胞的产生[0168]为了模拟人上呼吸道上皮细胞表面上的唾液酸(sia)分子的表达模式，我们首先尝试敲除β?半乳糖苷α2，3唾液酸转移酶(st3gal)基因，其产物催化具有α2，3键的sia转移至末端半乳糖(gal)残基处，通过使用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)/crispr相关蛋白9(cas9)基因编辑系统(cong et al.，2013；jinek et al.，2012；han et al.，2018；shalem et al.，2014)。狗具有七种不同的st3gal蛋白(st3gal?i、?ii、?iii、?iv、?v、?vi和st3gal?ii样蛋白)，每种蛋白质由不同的基因编码。st3gal?i、?ii、?iii、?iv和?vi使用在糖蛋白上的或在糖蛋白和糖脂上的寡糖作为接受体底物，而st3gal?v仅利用在糖脂上的寡糖(takashima和tsuji，2011)。先前的研究报道称，n?连接糖蛋白是流感病毒富有成效地进入宿主细胞所需要的(chu和whittaker，2004)。因此，为了抑制α2，3连接的sia向糖蛋白的转移，用六种质粒的混合物转染mdck细胞，每种质粒均包含cas9基因表达盒和用于靶向st3gal?i、?ii、?iii、?iv、?vi或st3gal?ii样蛋白基因的单独的指导rna(grna)的表达盒(图2)。在转染之后，向细胞添加嘌呤霉素，并随机挑取33种药物抗性克隆。基因组dna分析揭示，只有一种克隆(6?11)在grna靶区域中包含针对六种st3gal基因的突变(数据未示出)。细胞表面sia是使用对α2，3连接的sia具有特异性的山槐ii凝集素(mal ii)凝集素和对α2，6连接的sia具有特异性的接骨木凝集素(sna)凝集素，通过流式细胞术进行测量的。出乎意料地，亲本mdck细胞和克隆6?11之间与malii的反应性非常相似，指示该克隆仍表达高水平的α2，3连接的sia(图3)。这可能是由于st3gal?v的补偿活性。[0169]为了更高效地抑制α2，3连接的sia的转移并且在细胞表面上表达高水平的α2，6连接的sia，将克隆6?11与编码人β?半乳糖苷α2，6唾液酸转移酶i(st6gal?i)(其催化α2，6连接的sia添加至包含gal的聚糖)的质粒，以及包含cas9表达盒和靶向st3gal?v的grna的质粒共转染。用杀稻瘟素(blasticidin)选择了十八个细胞克隆并进行基因组dna分析。在药物抗性克隆中，9种在st3gal?v基因的grna靶标区域中具有突变(数据未示出)。使用mal ii和sna凝集素的流式细胞术分析显示，与亲本mdck细胞相比，九个克隆中的两个(克隆6?11#2和6?11#10)的α2，3连接的sia的表达显著降低，并且α2，6连接的sia的表达水平高于亲本细胞的表达水平(sy图4a；仅示出了克隆6?11#2和6?11#10的数据)。sia末端附接至糖蛋白或糖脂上的数种类型的寡糖结构，例如galβ1，4glcnac(glcnac；n?乙酰葡糖胺)、galβ1，3galnac(galnac；n?乙酰半乳糖胺)和galβ1，4glc(glc；葡萄糖)(takashima和tsuji，2011)。mal ii凝集素优先地识别siaα2，3galβ1，3galnac结构(hidari et al.，2013)。为了评估这两个克隆是否在细胞表面上表达不同类型的α2，3连接的寡糖结构，使用针对siaα2，3galβ1，4glcnac7的单克隆抗体进行了间接免疫荧光测定(immunofluorescence assay，ifa)分析。ifa显示siaα2，3galβ1，4glcnac的水平在这两个克隆中的一个(6?11#10)中检测不到或显著地低(图4b)，表明在克隆6?11#10中，包含末端α2，3连接的sia的多种类型的寡糖的表达水平低于其在亲本细胞中的表达水平。接下来，在ax4细胞和克隆6?11#10上α2，6连接的sia的细胞表面表达水平是通过使用sna和毛接骨木(ssa)凝集素来比较的，两种凝集素均识别siaα2，6gal或siaα2，6galnac结构(shibuya et al.，1989)。流式细胞术分析指示在ax4细胞与克隆6?11#10之间α2，6连接的sia的表达水平无差异(图4c)。然而，与ax4细胞相比，在克隆6?11#10中的通过使用mal ii凝集素测量的α2，3连接的sia的表达水平显著更低(图4d)。已证实克隆6?11#10在七种st3gal基因的grna靶标区域中包含所期望的突变(表1)。这些结果显示克隆6?11#10主要表达人病毒受体和有限量的禽病毒受体。得到的克隆6?11#10被定名为hck，并且随后进行扩增用于进一步的分析。[0170]表1.在mdck、ax4或hck细胞中传代之后分析的在病毒的ha和na的氨基酸变化a。[0171][0172]a从临床样本中分离的流感病毒在mdck、ax4或hck细胞中传代十次。在单次传代(p1)、第六次传代(p6)和第十次传代(p10)之后确定病毒的ha和na基因的序列。b甲型流感病毒的突变以h3编号显示。c所有突变均以n2编号显示。d?，与来自原始临床样本的序列相比，未检测到突变。et/i，在第167位的苏氨酸和异亮氨酸的混合物，fn/s，在第296位的天冬酰胺和丝氨酸的混合物。gn/s，在第446位的天冬酰胺和丝氨酸的混合物。hh/y，在第411c位的组氨酸和酪氨酸的混合物。ic/y，在第53位的半胱氨酸和酪氨酸的混合物。j未从mdck细胞的临床样本中分离出流感病毒。kn/k，在第158位的天冬酰胺和赖氨酸的混合物。ld/n，在第408位的天冬氨酸和天冬酰胺的混合物。ms/n，在第148位的丝氨酸和天冬酰胺的混合物。nd/n，在第459位的天冬氨酸和天冬酰胺的混合物。og/r，在第208位的甘氨酸和精氨酸的混合物。pn/s，在第196位的天冬酰胺和丝氨酸的混合物。ql/f，在第72位的亮氨酸和苯丙氨酸的混合物。[0173]在其st3gal基因中具有突变并表达st6gal?i和hat基因的稳定细胞系的建立。使用来自michael boutros实验室的sgrna设计工具(http：//www.e?crisp.org/e?crisp/)设计了各自针对st3gal?i、?ii、?iii、?iv、v、?vi和st3gal?ii样蛋白遗传基因座的grna序列。将grna的寡dna克隆至编码嘌呤霉素抗性的cas9/grna双表达载体pspcas9(bb)?2apuro(px459)(addgene)中。所得构建体定名为px459?st3gal?i、px459?st3gal?ii、px459?st3gal?iii、px459?st3gal?iv、px459?st3gal?v、px459?st3gal?vi、和px459?st3gal?ii样，其分别表达靶向st3gal?i、?ii、?iii、?iv、v、?vi和st3gal?ii样蛋白基因的grna。人st6gal?i基因通过pcr从pcaggs?flag?pur?st6gal?i质粒(hatakeyama et al.，2005)中进行扩增，并且随后用noti和xhoi进行消化。将消化的片段在真核表达载体pcag?bsd的noti和xhoi位点之间进行克隆，该载体编码杀稻瘟素抗性(wako)。所得构建体定名为pcag?bsd?st6gal?i，其表达st6gal?i。所有构建体均通过桑格测序(sanger sequencing)进行序列验证。使用bigdye终止子3.1版循环测序试剂盒(thermo fisher scientific)进行循环测序，并在abi prism 3130xl基因分析仪(thermo fisher scientific)上分析序列。[0174]使用amaxa核转染仪ii机器(lonza)根据制造商的说明进行电穿孔。简而言之，将5×105个mdck细胞重悬于100μl所期望的电穿孔缓冲液中，并与5μg的cas9/grna双表达载体(1μg px459?st3gal?i、1μg px459?st3gal?ii、1μg px459?st3gal?iii、1μg px459?st3gal?iv、1μg px459?st3gal?vi和1μg px459?st3gal?ii样)或1.7μg的px459?st3gal?v和1.7μg的pcag?bsd?st6gal?i进行混合。将重悬的细胞转移至比色皿并立即使用程序a?024进行电穿孔。在存在2μg/ml嘌呤霉素或10μg/ml杀稻瘟素的情况下将细胞在补充有5％ncs的mem中培养，以选择经转染的细胞。克隆使用克隆环进行分离，使用胰蛋白酶和edta进行解离，并进行扩增。使用基因组分离试剂盒(promega)根据制造商的说明分离基因组dna。使用围绕每个靶位点的引物通过pcr扩增靶区域，并通过使用零钝topo pcr克隆试剂盒(invitrogen)克隆扩增产物。每种基因随机选择至少八个克隆，并对分离的质粒进行测序。使用的引物的列表在表5中提供。[0175]流式细胞术分析。通过在包含0.125％胰蛋白酶?20mm edta的pbs(dojindo)中孵育10分钟来分离细胞。在用pbs洗涤之后，将细胞用无碳封闭液(vector)在4℃下封闭15分钟。将细胞在4℃下与生物素化mal ii、sna或ssa一起孵育30分钟。然后用pbs冲洗细胞，然后在4℃下与alexa 488缀合的链霉亲和素(invitrogen)一起孵育30分钟。使用facs calibur或facs verse(becton dickinson)测量荧光并使用flowjo软件(becton dickinson)对其进行分析。[0176]为了确认唾液酸特异性凝集素的结合，将细胞用产气荚膜梭菌(clostridium perflingense)(roche)在37℃下处理1小时，然后与凝集素一起孵育。如上所述检测与细胞结合的凝集素。[0177]免疫荧光染色。将在24孔板中培养的细胞在4℃下与识别siaα2，3galβ1，4glcnac(hyb4：wako)的小鼠单克隆抗体一起孵育。在孵育之后，将细胞用10％三氯乙酸在?20℃下固定10分钟。然后将细胞用pbs进行洗涤并与alexa 488缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白g(igg)(invitrogen)一起孵育30分钟。细胞核用hoechst 33342、三盐酸盐、三水合物(molecular probes)进行复染。通过使用zeiss荧光显微镜(成像仪型号z1；carl zeiss)检查样品。[0178]表a.在hck细胞中crispr/cas9靶位点的序列分析a。[0179][0180][0181]a将每种基因的pcr产物克隆至平端载体中并进行测序分析。[0182]表b.由每个grna引起的在α2，3唾液酸转移酶基因的突变[0183][0184]sgrna的序列通过粗体字母显示。带下划线的序列显示了pam序列。序列显示[0185]1该序列与px459载体上的某个序列匹配。[0186]表2.从临床样本中分离人流感病毒a。[0187][0188]a使用通过实时rt?pcr或快速诊断试剂盒显示出流感病毒阳性的临床样本进行病毒分离。b将临床样本接种至mdck、ax4和hck细胞中。持续7天观察细胞的细胞病变作用(cpe)的发生。在接种之后7天，来自cpe阴性细胞培养样品的上清液通过使用快速诊断试剂盒和用豚鼠红细胞的血细胞凝集测定进行测试。[0189]表3.[0190][0191][0192]a从mdck、ax4或hck细胞的临床样本中分离流感病毒。在mdck、ax4或hck细胞中分离之后确定病毒的ha和na基因的序列。b?，与来自原始临床样本的序列相比，未检测到突变。cd/g，在第151位的天冬氨酸和甘氨酸的混合物。dk/r，在第394位的赖氨酸和精氨酸的混合物。ed/n，在第151位的天冬氨酸和天冬酰胺的混合物。fs/p，在第221位的丝氨酸和脯氨酸的混合物。gd/n，在第246位的天冬氨酸和天冬酰胺的混合物。hk/i，在第160位的赖氨酸和异亮氨酸的混合物。ik/t，在第160位的赖氨酸和苏氨酸的混合物。jk/t，在第148位的赖氨酸和苏氨酸的混合物。k未从mdck和ax4细胞的临床样本中分离出流感病毒。l未从mdck细胞的临床样本中分离出流感病毒。mt/i，在第148位的苏氨酸和异亮氨酸的混合物。ne/k，在第433位的谷氨酸和赖氨酸的混合物。os/p，在第44位的丝氨酸和脯氨酸的混合物。[0193]表4.hck和ax4细胞对人流感病毒的敏感性的比较a。[0194][0195]a使用通过实时rt?pcr显示出流感病毒阳性的临床样本进行病毒分离。b制备临床样品的连续2倍稀释液(21至220)并接种至ax4和hck细胞中。持续7天观察细胞的cpe发生。使用三个孔感染相同稀释度的病毒，并示出了在所有三个孔中显示出cpe的最高稀释度。[0196]表5.使用的引物的列表。[0197][0198][0199][0200][0201][0202]afam，6?羧基荧光素；hex，六氯?6?羧基荧光素；bhq?1，黑洞猝灭剂；mgb，小沟黏合剂；tamra，6?羧基四甲基罗丹明。[0203]结果[0204]制备了新的mdck细胞系(定名为hck)，其过表达α2，6?唾液聚糖并表达极低水平的α2，3?唾液聚糖以模拟人上呼吸道上皮细胞的唾液酸表达模式(参见图2至4和表a)。[0205]为了确定hck细胞是否可支持人流感病毒的高效复制，对hck细胞中病毒[3个a/h1n1 2009大流行(a/h1n1pdm)、3个a/h3n2、3个b/yamagata谱系和3个b/victoria谱系]的生长动力学进行了检查。三个a/h1n1pdm分离株在mdck、ax4和hck细胞中高效生长，并且未观察到滴度的显著差异(图1a)。六个乙型流感分离株也在所有三种细胞系中以相似的效率复制。相比之下，对于a/h3n2病毒，与在ax4细胞中相比，所有三个分离株在hck细胞中生长要快得多并且滴度更高(在感染之后48小时高2.03至2.91 log单位)。正如其他地方(chambers et al.，2014)报道的，在mdck细胞中，这些近期a/h3n2分离株复制不佳。这些发现表明，与mdck或ax4细胞相比，表达非常低水平的α2，3?唾液聚糖和高水平的α2，6?唾液聚糖的hck细胞更高效地支持近期a/h3n2病毒的复制。[0206]为了评价hck细胞用于分离人流感病毒的易感性，将90个呼吸道样本(30个a/h1n1pdm、30个a/h3n2和30个b/yamagata谱系)的等分试样接种至mdck、ax4和hck细胞中。持续7天观察细胞的细胞病变作用(cpe)的发生。对于mdck、ax4和hck细胞，a/h1n1pdm病毒从所有rt?pcr阳性样品中成功回收，无需盲传(100％分离效率)(表2)。类似地，这三种细胞系用于分离乙型流感病毒时显示出100％的效率。对于a/h3n2阳性样品，分别从mdck和ax4细胞中未回收到5种和2种病毒。这些结果与先前的报道(oh et al.，2008；hatakeyama et al.，2005)一致，即传统mdck细胞用于检测近期a/h3n2病毒的灵敏度相对较低。[0207]流感病毒对红细胞的凝集被认为是由于病毒与细胞表面的唾液酸结合所致。自2005年以来，a/h3n2分离株失去了其凝集火鸡红细胞的能力(lin et al.，2013)。另外，目前的a/h3n2分离株显示豚鼠红细胞的凝集降低或无凝集(lin et al.，influenza other respir viruses，2017)，指示其对唾液酸受体的亲和力发生变化。事实上，lin et al.(2013)测量了近期a/h3n2病毒对α2，6连接的唾液酸受体的亲和力，并表明亲和力已急剧下降。聚糖阵列分析显示，近期a/h3n2分离株喜好与具有延长的聚n乙酰乳糖胺链的支化唾液酸化n?连接聚糖结合(peng et al.，cell host microbe.，2017)。[0208]相比之下，在所有样品的情况下从hck细胞中分离病毒均是成功的，没有任何后续盲传，这表明该细胞系比ax4或mdck细胞更有效地用于从临床样本中分离人a/h3n2病毒。[0209]在近期a/h3n2人分离株在mdck细胞中复制期间，病毒在na蛋白的第148和151位(例如t148i和d151g)处迅速发生氨基酸变化，这影响na的生物学特性。为了检查从三种细胞系中分离的a/h3n2病毒是否在其ha和na蛋白中具有突变，通过桑格测序确定了分离株的ha和na区段的核苷酸序列(表3)。序列分析显示，与来自原始样本的序列相比，25个mdck培养的分离株中有7个在na的第151位包含氨基酸变化：na?151n、na?151d/g和na?151d/n(在第151位的氨基酸混合群体)。在mdck培养一些其他分离株的病毒群