一种治疗高脂血症的发酵中药及其制备方法和应用

　　1.本发明涉及中药领域，特别是涉及一种治疗高脂血症的发酵中药及其制备方法和应用。背景技术：2.高脂血症是世界范围内的主要健康问题，是威胁人们健康的最常见的代谢性疾病之一，以血液中总胆固醇(total cholesterol，t-cho)、甘油三酯(triglyceride，tg)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，ldl-c)水平升高或高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，hdl-c)水平降低为主要临床特征，是动脉粥样硬化、脂肪肝、胰腺炎、冠心病等疾病的主要诱发因素。目前，高脂血症的治疗药物以贝特类及他汀类药物为主，但其作用靶点单一，长期服用易造成肌毒性等副作用。故寻求对高脂血症有治疗作用的药物是非常有必要的。3.中药发酵是指借助微生物和酶的催化分解作用，来达到增效、减毒或产生新药效的作用，大多数药物在发酵终点时产生黄白色菌衣。并有研究证实，发酵类中药可对高脂血症起到治疗作用，但由于现有技术多采用自然环境发酵，菌群复杂，容易造成发酵过程不可控，发酵终点难以统一，发酵质量无法得到保障等问题。技术实现要素：4.本发明的目的是提供一种治疗高脂血症的发酵中药及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的发酵中药，为湿阻中焦型高脂血症的治疗提供了新的备选药物，其降脂作用显著，且安全可靠，可调节肠道菌群，保护肝肾，无副作用。5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：6.本发明提供一株芽孢杆菌(bacillus sp.)jq.y-1，所述芽孢杆菌于2021年6月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：m2021761。7.本发明还提供上述的芽孢杆菌在提高中药组合物的药效中的应用。8.进一步地，所述中药组合物，按重量份计，包括以下组分：广藿香5～20份、厚朴5～20份、茯苓1～10份、陈皮1～10份、泽泻1～10份、白术1～10份、苍术2～9份、山楂4～18份、荷叶1～8份、薏苡仁5～20份和甘草1～5份。9.本发明还提供一种治疗湿阻中焦型高脂血症的发酵中药，所述发酵中药是由以下重量份的中药原料接种上述的芽孢杆菌发酵得到：广藿香5～20份、厚朴5～20份、茯苓1～10份、陈皮1～10份、泽泻1～10份、白术1～10份、苍术2～9份、山楂4～18份、荷叶1～8份、薏苡仁5～20份和甘草1～5份。10.进一步地，所述发酵中药的制备方法具体包括以下步骤：11.(1)将中药原料粉碎后，加入麦麸混匀，之后再与面粉糊混合均匀后，制成软材；12.(2)在所述软材中接种入权利要求1所述的芽孢杆菌，混合均匀后压块成型，之后再经发酵培养，干燥，得到所述发酵中药。13.进一步地，在步骤(1)中，所述面粉糊由面粉和水按照质量比1：(10～20)，混合制成。14.进一步地，在步骤(2)中，所述发酵培养的湿度为60～90％，温度为25～40℃，发酵时间为24～72h。15.本发明还提供一种治疗湿阻中焦型高脂血症的发酵中药制剂，所发酵中药制剂的有效成分是利用溶剂，对上述的发酵中药进行提取得到。16.进一步地，所述溶剂为水。17.进一步地，利用水对上述的发酵中药进行提取的温度为60～100℃。18.本发明公开了以下技术效果：19.本发明的发酵中药，以祛湿健脾为主，辅之行气和胃，使气行而湿化，具有祛湿健脾的作用，可用于湿阻中焦证的治疗。其表现多为脘腹胀满，进食尤甚，身重困倦，胃纳呆滞，舌苔白腻而厚，脉缓，与现代医学高脂血症相似，可为临床用药提供一种新思路。20.其中，方中广藿香辛温芳香，芳香化浊，辟秽和中，使湿去则脾运有权，脾健则湿邪得化；厚朴辛温而散，长于行气除满，脾气行则湿化，且其味苦性燥而能燥湿，二者共为君药。茯苓健脾渗湿以祛痰，陈皮辛行温通，理气和胃，燥湿醒脾，理气化痰，使气顺痰消，既可化已聚之痰，又能杜生痰之源，为臣药；泽泻性降，渗利泄浊，入泽泻以助茯苓利水，存白术意在健脾；苍术平胃土而祛湿；山楂化浊降脂，宜于寒湿中阻、脘痞纳差之证；荷叶清暑化湿，升发清阳，尤宜于脾虚泄泻；薏苡仁淡渗利湿以健脾，使湿从下焦而去，各药共为佐药。甘草调和诸药为使，能补能和，使湿去而土不伤，致于平和也。诸药相合使湿浊内化，气机通畅，脾胃调和，清升浊降，则诸症可除。21.本发明提供了一种治疗高脂血症的发酵中药，并且描述了其制备工艺，为湿阻中焦型高脂血症的治疗提供了治疗新的备选药物，其降脂作用显著，且安全可靠，可调节肠道菌群，保护肝肾，无副作用。22.本发明将菌株加入自然发酵进程中，较传统自然发酵方式，能够进一步保证发酵过程的稳定性，提高了本发酵中药治疗高脂血症的药效，为临床用药提供基础研究数据。附图说明23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。24.图1为菌株jq.y-1的菌落形态(a)及革兰氏染色结果(b)；25.图2为各组大鼠肝脏油红o染色结果(×200)；26.图3为各组大鼠肝组织中ampk、p-ampk、lkb1和hmgcr蛋白的免疫组化图(×200)；27.图4为各组大鼠肝组织中ampk(a)、p-ampk(b)、lkb1(c)、hmgcr(d)蛋白表达的iod值测定结果(n＝10，×104)；与正常组比较：*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组比较：#p＜0.05，##p＜0.01；28.图5为对高脂血症大鼠pcoa分析的影响；其中，con：正常组(control)，pos：阳性药组(positive)，hlp：模型组(hyperlipemia)，nf：自然发酵高剂量组(naturally fermentedtraditional chinese medicine)sf：菌株发酵高剂量组(strain fermented traditional chinese medicine)；29.图6为正常组、阳性药组、模型组、自然发酵高剂量组、菌株发酵高剂量组对高脂血症大鼠属水平聚类分析的影响；30.图7为正常组、阳性药组、模型组、自然发酵高剂量组、菌株发酵高剂量组对高脂血症大鼠属水平相对丰度的影响。具体实施方式31.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。32.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。33.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。34.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。35.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。36.下述实施例中所用的广藿香、厚朴、茯苓、陈皮、泽泻、白术、苍术、山楂、荷叶、薏苡仁和甘草均符合《中国药典》(2020年版)一部正文各项下的有关规定。37.实施例1菌株分离、鉴定、保藏和培养38.1.分离39.从治疗高脂血症的自然发酵中药中分离纯化培养得到一株菌，编号jq.y-1。40.2.鉴定41.形态学鉴定：如图1所示，菌株jq.y-1的革兰氏染色结果显示该菌株为革兰氏阳性菌，菌落形态圆形，黄白色，表面颗粒状，略皱缩，粗糙湿润，易挑起，显微下呈现球形。42.生理生化鉴定：菌株jq.y-1的氧化酶、接触酶试验阳性，vp试验为阳性，能水解淀粉。43.分子生物学鉴定：44.由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，jq.y-1的16s rdna测序结果为：45.catggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagcca。46.经鉴定，jq.y-1属于芽孢杆菌属(bacillus sp.)。47.3.保藏48.jq.y-1于2021年6月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：m2021761。49.4.培养50.将jq.y-1接种于lb液体培养基，37℃培养48h，得到发酵液。将发酵液离心，去除上清，菌泥重悬于无菌生理盐水，分别制备成浓度为105～1010cfu/ml的菌悬液。51.实施例252.原料：广藿香9g、厚朴9g、茯苓5g、陈皮6g、泽泻6g、白术6g、苍术6g、山楂9g、荷叶6g、薏苡仁9g、甘草3g、麦麸14.8g、面粉7.4g。53.(1)粉碎：分别称取上述的原料，将广藿香、厚朴、茯苓、陈皮、泽泻、白术、苍术、山楂、荷叶、薏苡仁和甘草粉分别碎成80目的细粉，麦麸过30目筛，之后混合均匀制成药粉；54.(2)软材制备混合压块成型：将面粉加入148g水制成稀糊，煮沸，趁热与步骤(1)所得药粉揉合均匀，以手捏成团，掷之即散，制成软材；55.(3)接种菌株和发酵：在步骤(2)得到的软材中加入0.6ml实施例1制备得到的浓度为108cfu/ml的菌悬液，混合均匀，压块成型，定型成砖块状，置于30℃、80％相对湿度的恒温恒湿培养箱中，发酵36h取出，于60℃烘箱干燥，得到发酵中药。发酵过程中保持块间留有空隙，至发酵终点时应布有白色菌丝且无黑色孢子。56.(4)制剂：将步骤(3)制备得到的发酵中药以5倍重量的水提取三次，每次100℃，30min，冷却过滤，合并收集三次滤液，保存备用，得到用于治疗高脂血症的发酵中药制剂。57.实施例358.同实施例2，区别仅在于，原料为：广藿香5g、厚朴20g、茯苓1g、陈皮10g、泽泻1g、白术10g、苍术2g、山楂18g、荷叶1g、薏苡仁20g、甘草5g、麦麸25g、面粉3g。59.(1)粉碎：分别称取上述的原料，将广藿香、厚朴、茯苓、陈皮、泽泻、白术、苍术、山楂、荷叶、薏苡仁和甘草分别粉碎成120目的细粉，麦麸过10目筛，之后混合均匀制成药粉；60.(2)软材制备：将面粉加入84g水制成稀糊，煮沸，趁热与步骤(1)所得药粉揉合均匀，以手捏成团，掷之即散，制成软材；61.(3)接种菌株和发酵：在步骤(2)得到的软材中加入1ml实施例1制备得到的浓度为105cfu/ml的菌悬液，混合均匀，压块成型，定型成砖块状，置于25℃、60％相对湿度的恒温恒湿培养箱中，发酵24h取出，于80℃烘箱干燥，得到发酵中药。发酵过程中保持块间留有空隙，至发酵终点时应布有白色菌丝且无黑色孢子。62.(4)制剂：将步骤(3)制备得到的发酵中药以5倍重量的水提取三次，每次80℃，30min，冷却过滤，合并收集三次滤液，保存备用，得到用于治疗高脂血症的发酵中药制剂。63.实施例464.同实施例2，区别仅在于，原料为：广藿香20g、厚朴5g、茯苓10g、陈皮1g、泽泻10g、白术1g、苍术9g、山楂4g、荷叶8g、薏苡仁5g、甘草1g、麦麸10g、面粉15g。65.(1)粉碎：分别称取上述的原料，将广藿香、厚朴、茯苓、陈皮、泽泻、白术、苍术、山楂、荷叶、薏苡仁和甘草分别粉碎成120目的细粉，麦麸过30目筛，之后混合均匀制成药粉；66.(2)软材制备：将面粉加入84g水制成稀糊，煮沸，趁热与步骤(1)所得药粉揉合均匀，以手捏成团，掷之即散，制成软材；67.(3)接种菌株和发酵：在步骤(2)得到的软材中加入0.8ml实施例1制备得到的浓度为1010cfu/ml的菌悬液，混合均匀，压块成型，定型成砖块状，置于40℃、90％相对湿度的恒温恒湿培养箱中，发酵72h取出，于70℃烘箱干燥，得到发酵中药。发酵过程中保持块间留有空隙，至发酵终点时应布有白色菌丝且无黑色孢子。68.(4)制剂：将步骤(3)制备得到的发酵中药以5倍重量的水提取三次，每次60℃，30min，冷却过滤，合并收集三次滤液，保存备用，得到用于治疗高脂血症的发酵中药制剂。69.对比例170.同实施例2，区别仅在于，未加入实施例1制备得到的菌悬液。71.效果验证72.以下通过对实施例1的具体药效学实验证明本发明的治疗效果。73.1.动物74.种属：spf级sd大鼠75.来源：购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证：scxk(鲁)2018000376.性别：雄性77.体重：180～220g78.饲养条件：实验期间动物饲养室环境温度为20～25℃，相对湿度为55～60％，正常光照，大鼠自由饮水采食，大鼠饮用水均为实验室自用超纯水。79.经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准后进行，批准编号为dwllgzr20220221180.2.实验方法81.将70只sd大鼠分为7组，包括正常组、模型组、阳性药组、自然发酵低高剂量组、菌株发酵低高剂量组。正常组给予普通维持饲料，其余各组均连续给予高脂饲料6w，建立高脂血症(hyperlipidemia，hlp)模型。模型建立成功后，按照表1所示对各组进行给药，每日1次，连续6w。82.表183.组别给药剂量正常组蒸馏水10ml/kg模型组蒸馏水10ml/kg阳性药组辛伐他汀片按照20mg/kg剂量给药自然发酵低剂量组对比例1制备得到的发酵中药制剂按照1600mg·kg-1剂量给药自然发酵高剂量组对比例1制备得到的发酵中药制剂按照8000mg·kg-1剂量给药菌株发酵低剂量组实施例2制备得到的发酵中药制剂按照1600mg·kg-1剂量给药菌株发酵高剂量组实施例2制备得到的发酵中药制剂按照8000mg·kg-1剂量给药84.3.药效研究85.①大鼠体质量增长情况86.造模期间每7d称定大鼠体质量1次，观测大鼠体重，体重过轻者单独饲养，减少高脂饲料摄入不均造成的个体间差异；给药期间每7d称定大鼠体质量1次，调整灌胃量，并观察不同药物对大鼠体质量变化的影响，进行组间统计学分析。给药期间，与正常组相比，模型组体重显著升高(p＜0.01)；给药第6w，与模型组相比，给药各组体重均显著下降(p＜0.01)，与正常组相比，阳性药组大鼠体重有所下降(p＜0.05)，发酵品高剂量组大鼠体重显著下降(p＜0.01)。87.②大鼠血脂水平及肝肾功能水平88.与空白组比较，模型组大鼠血清hdl-c水平显著降低(p＜0.01)，其余各指标水平明显升高(p＜0.01)。tc检测结果表明，与模型组相比，阳性药组、自然发酵与菌株发酵高剂量组大鼠tc水平显著降低(p＜0.01或p＜0.05)；tg、ldl-c、ast检测结果表明，与模型组相比，各给药组大鼠tg、ldl-c、ast水平均显著降低(p＜0.01)；hdl-c结果显示，与模型组相比，阳性药组、菌株发酵高剂量组大鼠hdl-c水平显著升高(p＜0.01或p＜0.05)；alt结果表明，与模型组相比，阳性药组、自然发酵与菌株发酵高剂量组大鼠alt水平显著降低(p＜0.01)；bun、cr结果表明，阳性药组、自然发酵中药高剂量组与菌株发酵中药低、高剂量组可显著改善肾脏指标水平(p＜0.01或p＜0.05)。89.③大鼠肝脏组织病理变化90.正常组大鼠肝脏肝细胞内间隙清晰，见极少量橘红色脂滴；模型组大鼠肝细胞内遍布橘红色视野，可见弥漫性脂滴，细胞核受损，且肝脏内有明显沉积的肝脏脂质。与模型组相比，阳性药组及菌株发酵中药低、高组橘红色脂滴明显减少，脂质沉积明显减少，尤以菌株发酵中药高剂量组与正常组iod值(积分光密度值)接近，见图2。91.④大鼠ampk、p-ampk、lkb1及hmgcr蛋白表达情况92.与正常组相比，模型组大鼠肝脏组织中ampk、p-ampk、lkb1蛋白的iod值均显著降低(p＜0.01)，hmgcr蛋白的iod值显著升高(p＜0.01)。与模型组大鼠相比，各给药组大鼠肝组织中ampk、p-ampk、lkb1蛋白的iod值均有所升高，以阳性药组及菌株发酵中药高剂量组明显(p＜0.01)；与模型组相比，各给药组大鼠肝组织中hmgcr蛋白iod值均显著降低(p＜0.01或p＜0.05)。各组大鼠肝组织中ampk、p-ampk、lkb1、hmgcr蛋白的免疫组化结果见图3，iod值测定结果见图4。93.因上述各血清指标水平、肝脏病理切片及免疫组化结果均显示高剂量组较低剂量组对高血脂症大鼠调节作用更强，且考虑到各低剂量组由于干预时间过短，调节作用可能尚未凸显，故本菌群研究不针对自然发酵低剂量组及菌株发酵低剂量组进行，以下肠道菌群测序结果均仅针对自然发酵高剂量组及菌株发酵高剂量组大鼠粪便菌群。94.⑤大鼠肠道菌群beta多样性分析95.beta多样性是指不同环境群落之间的物种差异性。主成分分析(pca，principal componentanalysis)，能够提取出最大程度反映样品间差异的两个坐标轴，将多维数据的差异反映在二维坐标图上。如图5所示，两坐标轴pca1与pca2总和为63.26％，说明该分析较为可靠；且正常组与模型组存在明显差异，给药各组较模型组菌群均有回调，且以菌株发酵高剂量组与正常组菌群相似度极高。96.⑥大鼠属水平肠道菌群差异性分析97.在属水平上，各组大鼠肠道菌群的组成分布如图6和图7所示。正常组大鼠肠道菌群相对丰度排名靠前的菌属包括ligilactobacillus(15.55％)、firmicutes_unclassified(8.22％)、lachnospiraceae_nk4a136_group(7.64％)；模型组大鼠中优势菌属包括akkermansia(17.61％)、ligilactobacillus(11.71％)、lactobacillus(7.94％)。与正常组相比，模型组大鼠粪便中ligilactobacillus、firmicutes_unclassified、lachnospiraceae_nk4a136_group、clostridia_ucg-014_unclassified等有益菌属降低，自然发酵高剂量组及菌株发酵高剂量组有所回调。分组柱状图及热图显示，自然发酵中药及菌株发酵中药与正常组聚为一类，说明菌株发酵中药对高脂血症大鼠肠道菌群紊乱有改善作用，且菌株发酵中药大鼠菌群占比与正常组大鼠最为相近。98.综上所述，该菌株发酵中药对高脂血症大鼠有良好的治疗效果，可回调高脂血症大鼠的体质量，可显著降低高脂血症大鼠血清中血脂四项水平，能明显改善肝组织中脂质沉积，降低肝细胞脂肪变性程度，对肝肾功能起到改善作用。同时免疫组化结果显示，与模型组相比，该菌株发酵中药高剂量组肝组织中有大量ampk、p-ampk、lkb1蛋白沉积，有少量hmgcr蛋白沉积，说明该菌株发酵中药可增强lkb1/ampk信号通路的传导。肠道菌群测序结果显示，该菌株发酵中药可调节高脂血症大鼠肠道菌群结构，增加厚壁菌门(firmicutes)、ligilactobacillus(属)、lachnospiraceae_nk4a136_group(属)的相对丰度，恢复正常菌群结构。99.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。