CAMKII-δ9拮抗剂及其用途

　　camkii-δ9拮抗剂及其用途技术领域1.本发明涉及生物医学领域。特别是，本发明涉及camkii-δ9拮抗剂及其用途。背景技术：2.在生物体的整个生命周期中，基因组不断受到各种内部和外部压力信号的攻击，导致dna损伤。过度的dna损伤会损害基因组完整性，并阻碍dna复制和转录(campisi,j.&d'adda di fagagna,f.nature reviews.molecular cell biology 8,729-740,doi:10.1038/nrm2233(2007))。作为一种保护措施，dna修复可以抵御有害的dna损伤，从而保持基因组稳定性和细胞活力。异常的dna修复会导致dna损伤的积累和基因组的不稳定，从而导致细胞死亡。由于哺乳动物的心肌细胞几乎没有再生能力，终末分化的心肌细胞的丧失是许多类型心脏类疾病的常见病因，包括心肌梗塞、心肌病和心力衰竭。然而，心肌细胞dna修复的潜在机制在很大程度上仍然是未知的。3.ca2+/钙调蛋白依赖性激酶ii(camkii)是多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，其参与调节心肌细胞生存和细胞死亡(erickson,j.r.,he,b.j.,grumbach,i.m.&anderson,m.e.physiological reviews 91,889-915,doi:10.1152/physrev.00018.2010(2011))。camkii由四个基因编码，camkii-α、β、γ和δ，camkii-δ主要在心脏中表达。camkii-δ在两个可变域选择性剪接??在外显子13和17之间(可变域1)以及外显子20和22之间(可变域2)??产生11种不同的剪接变体。特别是，camkii-δ2(也称为camkii-δc)和camkii-δ3(或camkii-δb)先前已被鉴定为主要的心脏剪接变体，它们分别位于细胞质和细胞核中。新出现的证据表明，camkii-δ2和δ3对心肌细胞活力产生不同甚至相反的影响(peng,w.等人circulation research 106,102-110,doi:10.1161/circresaha.109.210914(2010))。然而，人们对心脏中camkii-δ9的生理和病理功能知之甚少。技术实现要素：4.在本发明中，本发明人已经将camkii-δ9，而不是经过充分研究的camkii-δ2和δ3鉴定为人类心脏中主要的camkii-δ剪接变体。在对各种刺激的反应中，camkii-δ9被上调，并且在触发心肌细胞dna损伤、基因组不稳定和心脏病变方面比其他剪接变体(camkii-δ2和δ3)更有力。本发明人还破译了由外显子13-16-17编码的肽，即camkii-δ9的特征序列，赋予对ube2t磷酸化和降解的剪接变体特异性调节。5.在一个方面，本发明公开了治疗或预防受试者的camkii介导的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的camkii-δ9拮抗剂。6.在另一个方面，本发明公开了减轻受试者的心脏损伤的方法，其包括向受试者施用有效量的camkii-δ9拮抗剂。7.在又一个方面，本发明公开了刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的方法，其包括向受试者施用有效量的camkii-δ9拮抗剂。8.在又一个方面，本发明公开了防止受试者的泛素结合酶降解的方法，其包括向受试者施用有效量的camkii-δ9拮抗剂。9.在又一个方面，本发明公开了防止样本中心肌细胞死亡的方法，其包括使样本与有效量的camkii-δ9拮抗剂接触。10.在又一个方面，本发明公开了减少细胞中dna损伤的方法，其包括使细胞与有效量的camkii-δ9拮抗剂接触。11.在一些实施方式中，本文公开的camkii-δ9拮抗剂能够抑制camkii-δ9的激活或抑制camkii-δ9的激酶活性。在一些实施方式中，camkii-δ9通过camkii-δ9本身的磷酸化和/或氧化而被激活。在一些实施方式中，camkii-δ9的激酶活性显示为其磷酸化其底物的能力，例如泛素结合酶，或更具体地，泛素结合酶2t(ube2t)。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是一种用于抑制泛素结合酶磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，泛素结合酶是ube2t。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制ube2t在ser110处磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂是camkii-δ9的特异性拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂抑制camkii-δ9的水平或活性，但不显著抑制camkii-δ2或camkii-δ3的水平或活性。12.在一些实施方式中，拮抗剂是特异性识别camkii-δ9的抗体、与camkii-δ9结合的小分子化合物、靶向camkii-δ9编码序列的rnai分子、靶向camkii-δ9编码序列的反义核苷酸或与camkii-δ9竞争结合其底物的药剂。13.在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或全人类抗体。在一些实施方式中，抗体与camkii-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列结合。14.在一些实施方式中，rnai分子是小干扰rna(sirna)、小发夹rna(shrna)或微小rna(mirna)。在一些实施方式中，rnai分子具有10-100个碱基。在一些实施方式中，反义核苷酸经修饰以提高其稳定性。在一些实施方式中，rnai分子和反义核苷酸与camkii-δ基因的外显子16结合。在一些实施方式中，rnai分子和反义核苷酸与camkii-δ基因的外显子13和外显子16(在本发明中也称为“外显子13-16”)，或camkii-δ基因的外显子16和外显子17(在本发明中也称为“外显子16-17”)，或camkii-δ基因的外显子13和外显子16和外显子17(在本发明中也称为“外显子13-16-17”)结合。15.在一些实施方式中，与camkii-δ9竞争结合其底物的药剂是表达无磷酸化或无氧化功能的camkii-δ9的载体。在一些实施方式中，载体是腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或质粒。在一些实施方式中，aav是aav1、aav2、aav5、aav8、aav9或aavrh10。16.在一些实施方式中，受试者是人类或非人灵长类动物。在一些实施方式中，非人灵长类动物是恒河猴。在一些实施方式中，受试者是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。17.在一些实施方式中，camkii介导的疾病与camkii-δ9的水平或活性增加有关。在一些实施方式中，camkii介导的疾病是心脏类疾病或代谢类疾病。在一些实施方式中，心脏类疾病选自由以下组成的组：心肌病、心肌炎、糖尿病性心脏病、心肌缺血、心脏缺血/再灌注损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂、心绞痛、心脏肥大、心脏损伤、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心绞痛、心肌炎、冠心病和心包炎。在一些实施方式中，心脏类疾病是肥厚型心肌病。在一些实施方式中，代谢类疾病选自由以下组成的组：胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病、高血压、血脂异常、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖症、高血脂症、痛风和高尿酸血症。18.在另一个方面，本发明涉及用于诊断受试者的camkii介导的疾病的方法，其包括：(a)获得受试者的测试生物样本；(b)检测测试生物样本中camkii-δ9的水平或活性；其中在受试者的测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性指示受试者罹患camkii介导的疾病或罹患camkii介导的疾病的概率增加。19.在一些实施方式中，测试生物样本中camkii-δ9的水平或活性是通过使样本与特异性结合camkii-δ9的试剂接触来检测。在一些实施方式中，将在测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性与在参考样本中检测到的camkii-δ9的参考水平或活性进行比较。在一些实施方式中，在测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性高于camkii-δ9的参考水平或活性指示受试者罹患camkii介导的疾病或罹患camkii介导的疾病的概率增加。在一些实施方式中，参考样本来自健康受试者，或者是比测试生物样本更早或更晚从同一受试者获得的样本。在一些实施方式中，测试生物样本来自受试者的心脏。在一些实施方式中，受试者是人类或非人灵长类动物。20.在另一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的camkii介导的疾病的试剂盒，其包含特异性识别camkii-δ9的抗体或抗体片段。21.在另一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的camkii介导的疾病的生物标志物，其中生物标志物包括camkii-δ9的全长蛋白质序列或其片段。在一些实施方式中，生物标志物包括如seq id no:1-5所示的氨基酸序列。22.在另一个方面，本发明公开了camkii-δ9作为用于诊断受试者的camkii介导的疾病的生物标志物的用途。23.在另一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制camkii-δ9活性的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和ube2t接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了抑制camkii-δ9的分子。24.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制camkii-δ9磷酸化能力的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和ube2t接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了抑制camkii-δ9磷酸化能力的分子。25.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制camkii-δ9本身磷酸化和/或氧化的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和可以检测camkii-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平降低鉴定了抑制camkii-δ9磷酸化和/或氧化的分子。26.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定治疗或预防camkii介导的疾病的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和ube2t接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了治疗或预防camkii介导的疾病的分子。27.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定治疗或预防camkii介导的疾病的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和可以检测camkii-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平降低鉴定了治疗或预防camkii介导的疾病的分子。28.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减轻心脏损伤的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和ube2t接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了减轻心脏损伤的分子。29.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减轻心脏损伤的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和可以检测camkii-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平降低鉴定了减轻心脏损伤的分子。30.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定防止心肌细胞死亡的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和ube2t接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了防止心肌细胞死亡的分子。31.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定防止心肌细胞死亡的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和可以检测camkii-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平降低鉴定了防止心肌细胞死亡的分子。32.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减少dna损伤的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和ube2t接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了减少dna损伤的分子。33.在一些实施方式中，ube2t磷酸化是在ser110处。34.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减少dna损伤的分子的方法，其包括使分子与camkii-δ9和可以检测camkii-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的camkii-δ9的水平降低鉴定了减少dna损伤的分子。35.在另一个方面，本发明公开了分离的camkii-δ多肽，其包含如seq id no:1所示的氨基酸序列、如seq id no:2所示的氨基酸序列、如seq id no:3所示的氨基酸序列、如seq id no:4所示的氨基酸序列、如seq id no:5所示的氨基酸序列或与如seq id no:1-5所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。36.在又一个方面，本发明公开了分离的camkii-δ核酸，其包含编码本发明多肽的核酸序列。在一些实施方式中，camkii-δ核酸包含选自由以下组成的组的核酸序列之一：seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19以及与seq id no:6-19具有至少80％同源性的核酸序列。37.在又一个方面，本发明公开了能够抑制camkii-δ9的水平或活性的camkii拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制泛素结合酶磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，泛素结合酶是ube2t。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制ube2t在ser110处磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂是camkii-δ9的特异性拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂抑制camkii-δ9的水平或活性，但不显著抑制camkii-δ2或camkii-δ3的水平或活性。在一些实施方式中，拮抗剂是与camkii-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向camkii-δ基因的外显子16的rnai分子或靶向camkii-δ基因的外显子16的反义核苷酸。在一些实施方式中，拮抗剂是与camkii-δ基因的外显子13和外显子16编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向camkii-δ基因的外显子13和外显子16的rnai分子或靶向camkii-δ基因的外显子13和外显子16的反义核苷酸。在一些实施方式中，拮抗剂是与camkii-δ基因的外显子16和外显子17编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向camkii-δ基因的外显子16和外显子17的rnai分子或靶向camkii-δ基因的外显子16和外显子17的反义核苷酸。在一些实施方式中，拮抗剂是与camkii-δ基因的外显子13、外显子16和外显子17编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向camkii-δ基因的外显子13、外显子16和外显子17的rnai分子或靶向camkii-δ基因的外显子13、外显子16和外显子17的反义核苷酸。在一些实施方式中，拮抗剂是与全长camkii-δ9的氨基酸序列结合的抗体、靶向全长camkii-δ9的编码序列的rnai分子或靶向全长camkii-δ9的编码序列的反义核苷酸。38.在又一个方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含本发明的拮抗剂和药学上可接受的载体。附图说明39.图1说明camkii-δ9是重要的心脏胞质camkii-δ剪接变体。(a)，小鼠、大鼠、恒河猴和人类心脏中所有camkii-δ剪接变体的剪接情况和表达水平。转录图显示了通过smrt测序获得的11个报告的选择性剪接变体(行)。外显子(列)如果存在则为黑色，并在底部编号(下列，utr区；黑线，外显子连接)。每个框的长度与每个外显子的长度成正比，每个剪接变体的百分比用条形图表示(右图，camkii-δ9为灰色)，一些主要变体的绝对读数显示在条形图上(每个物种有3个样本被汇集在一起)。(b)，用外显子21抗体对小鼠心脏的总蛋白进行相互免疫沉淀，并用外显子16抗体进行探测，反之亦然。ip(input)泳道来自同一膜的较长时间的暴露。n＝3个生物独立样本。(c)，在用抗外显子21或抗外显子16免疫沉淀的人类心脏中，通过定量质谱分析的camkii-δ外显子拼接体的相对肽量。n＝3个(左图)和8个(右图)生物独立样本。(d)，感染了ad-flag-camkii-δ9和ad-ha-camkii-δ2的nrvm中flag-camkii-δ9(右上图)和ha-camkii-δ2(左下图)的胞质位置的免疫荧光共聚焦显微图像。比例尺，10μm。n＝6个生物独立样本。(e)、(f)，暴露在1μm阿霉素(24小时)(e，n＝12个(媒剂)和10个(dox)生物独立样本)或200μm h2o2(24小时)(f，n＝7个(媒剂)和5个(h2o2)生物独立样本)的nrvm中的camkii-δ9蛋白水平。(g)、(h)，肥大小鼠心脏(tac 2周)(g，n＝5只(假手术)和6只(tac)生物独立动物)和患有肥厚型心肌病(hcm)的人的心肌组织(h，n＝7个(正常人)和6个(hcm)生物独立样本)的camkii-δ9蛋白水平及其相应对照。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析(c，左图)，双侧学生t检验(c，右图，e-h)。40.图2说明camkii-δ9通过下调ube2t诱导心肌细胞死亡。(a)、(b)，在存在或不存在h2o2(200μm)(a)或dox(1μm)(b)的情况下，用加扰或camkii-δ9sirna处理的nrvm中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝6个生物独立样本。(c)，以指定moi感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ9和ad-camkii-δ248小时的nrvm中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝6个(ad-β-gal和ad-camkii-δ9)和4个(ad-camkii-δ2)生物独立样本。(d)，在感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ9或ad-camkii-δ2(moi 50，48小时)的nrvm中，通过实时pcr分析的由camkii-δ9而不是camkii-δ2上调的3个基因的mrna水平的平均数据。n＝14个生物独立样本。(e)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示camkii-δ9，而不是δ2，以剂量依赖性方式减少ube2t。n＝8个生物独立样本。(f)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示在用加扰或camkii-δ9sirna转染的nrvm中ube2t的表达。n＝5个生物独立样本。(g)，感染了ad-β-gal和ad-camkii-δ9(moi 50，48小时)并且有或没有ube2t过表达的nrvm中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝5个生物独立样本。(h)，用加扰或ube2t sirna处理60小时的nrvm中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝5个生物独立样本。(i)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示在存在或不存在h2o2(200μm)的情况下，ube2t在nrvm中的表达。n＝5个生物独立样本。(j)，在有或没有ube2t过表达并暴露于h2o2(200μm)的nrvm中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝8个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。双因素方差分析(a、b、g、j)，单因素方差分析(c、d、e、h)或双侧学生t检验(f、i)。41.图3说明camkii-δ9通过破坏ube2t介导的dna修复来诱导心肌细胞dna损伤和基因组不稳定。(a)，感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ2或ad-camkii-δ9(moi 50，48小时)的γh2ax阳性nrvm的代表性免疫染色和统计数据。n＝6个生物独立样本。箭头指示γh2ax阳性细胞核。比例尺，20μm。(b)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示camkii-δ9在nrvm中剂量依赖性地增加γh2ax。n＝10个生物独立样本。(c)，通过彗星分析法评估的感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ2或ad-camkii-δ9(moi 50，48小时)的nrvm的dna损伤。n＝6个生物独立样本。箭头指示具有dna损伤的细胞核。比例尺，20μm。(d)、(e)，在存在或不存在h2o2(100μm，10分钟)的情况下，通过γh2ax免疫染色(d)和彗星分析法(e)评估的用加扰或camkii-δ9sirna处理的nrvm的dna损伤。n＝6个生物独立样本。(f)、(g)，通过γh2ax免疫染色(f)和彗星分析法(g)评估的感染了ad-β-gal或ad-ube2t并且有或没有camkii-δ9过表达(moi 50，48小时)的nrvm的dna损伤。n＝6个生物独立样本。(h)、(i)，在存在或不存在h2o2(100μm，10分钟)的情况下，通过γh2ax免疫染色(h)和彗星分析法(i)评估的感染了ad-β-gal或ad-ube2t的nrvm的dna损伤。n＝6个生物独立样本。(j)、(k)，通过γh2ax免疫染色(j)和彗星分析法(k)评估的用加扰或ube2t sirna处理60小时的nrvm的dna损伤。n＝6个生物独立样本。(l)、(m)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示感染了加扰、fancd2(l)或fanci(m)sirna的nrvm中的γh2ax水平。n＝4个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析(a、b、c、j、k、l、m)，或双因素方差分析(d-i)。42.图4说明心肌病和心力衰竭中camkii-δ9-ube2t-dna损伤信号传导的增强。(a-d)，wt和camkii-δ9tg小鼠的心肌camkii-δ9蛋白水平(a，n＝8只生物独立动物)、kaplan-meier生存曲线(b，n＝20只(wt)和22只(camkii-δ9tg)生物独立动物)、心脏总体形态(c，n＝15只(wt)和9只(camkii-δ9tg)生物独立动物)以及心脏tunel染色的统计数据(d，n＝5只生物独立动物)。比例尺，2mm。(e)、(f)，6周龄和10周龄wt和camkii-δ9tg小鼠的代表性超声心动图(e)和统计数据(f)。n＝13只(wt 6周)、15只(wt 10周)、15只(camkii-δ9tg 6周)和9只(camkii-δ9tg 10周)生物独立动物。ef，射血分数；fs，缩短分数；lvidd和lvids，舒张期和收缩期左心室内径；lvpwd和lvpws，舒张期和收缩期左心室后壁厚度。(g)，10周龄wt和camkii-δ9tg小鼠心脏γh2ax染色的统计数据。n＝6只生物独立动物。(h)，10周龄wt和camkii-δ9tg小鼠的心脏ube2t蛋白水平。n＝5只(wt)和6只(camkii-δ9tg)生物独立动物。(i)，10周龄wt和camkii-δ9shrna转基因(shrna tg)小鼠心脏中的camkii-δ9蛋白水平。n＝14只(wt)和11只(shrna tg)生物独立动物。(j-m)，tac手术后4周wt和shrna tg小鼠的ef和fs的统计数据(j，n＝10只(假手术)和16只(wt tac)和9只(shrna tgtac)生物独立动物、kaplan-meier生存曲线(k，n＝17只(wt)和28只(shrna tg)生物独立动物、心脏γh2ax(l，n＝5只生物独立动物)以及tunel(m，n＝5只生物独立动物)染色。数据为平均值±s.e.m.。双侧学生t检验(a、d、g-i、l、m)，对数秩(mantel-cox)检验(b、k)或双因素anova(f、j)。43.图5说明ube2t的过表达减弱camkii-δ9诱导的dna损伤、心肌细胞死亡和心肌病。(a)，ube2ttg小鼠的构建示意图。(b)，wt和camkii-δ9tg小鼠与wt和ube2ttg小鼠杂交的ha-camkii-δ3和ad-ube2t-myc的nrvm中，camkii-δ3与ube2t的免疫共沉淀。ip(input)代表用于每次免疫沉淀的全细胞溶解物的6％。n＝4个生物独立样本。(d)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示是camkii-δ9，而不是δ3，降低了nrvm中的ube2t。n＝6个生物独立样本。(e)，在用相应外显子拼接体(带flag-gfp标签)或ube2t-myc的质粒转染的hek293细胞中，camkii-δ外显子拼接体外显子13-16-17编码的肽与ube2t的免疫共沉淀。n＝4个生物独立样本。(f)，显示camkii-δ9介导的心脏dna损伤和心肌细胞死亡信号传导的示意图。在正常情况下，ube2t保护基因组免受各种类型的dna损伤，以维持心肌细胞的生存。当心肌细胞受到损伤时，camkii-δ9被上调和过度激活，这增强了ube2t的ser110磷酸化和后续降解。ube2t水平降低会损害dna修复机制，导致dna损伤的积累、基因组不稳定和细胞死亡。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析。47.图9说明camkii-δ9存在于心脏中。(a)，camkii-δ剪接变体的示意图。camkii-δ主要在两个可变域发生选择性剪接事件，一个在外显子13和17之间，另一个在外显子20之后。外显子被编号，全尺寸框代表编码外显子，而较小的绿色框代表非翻译区(utr)，特殊外显子被着色。(b)，全长camkii-δ转录物的smrt测序策略。camkii-δ转录物是从不同物种的心脏中分离出的总rna逆转录而来。每个cdna用成对的引物扩增，其位置用不同颜色的箭头标记。正向引物(左)位于外显子1上，反向引物(右)位于外显子22上。pcr产物经浓缩和纯化用于smrt测序。(c-e)，通过rna-seq分析人、恒河猴、狗、大鼠和小鼠心脏中可变域1(外显子13和17之间(c)和外显子14-17之间(d))和可变域2(外显子20和22之间)(e)的camkii-δ外显子拼接体的百分比。在e图中，在猴和人的心脏中，外显子20b是外显子20的另一种形式，它比经典的外显子20长147个碱基，以前没有描述过。数据为平均值±s.e.m.(n＝8个(人和大鼠)、7个(恒河猴)和6个(狗和小鼠)生物独立样本)。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析。48.图10说明心脏中camkii-δ9蛋白的鉴定。(a)，用作产生抗体的抗原的外显子16和21的肽序列。(b)，用ad-β-gal、ad-ha-camkii-δ2、ad-ha-camkii-δ3或ad-flag-camkii-δ9转染的nrvm与含有抗外显子16或抗外显子21的血清的免疫印迹。n＝3个生物独立样本。(c)、(d)，带flag标签的camkii-δ9重组蛋白与抗外显子16(c)和抗外显子21(d)的蛋白质印迹，其中相应的抗原肽与camkii-δ9蛋白的比例增加。n＝4个生物独立样本。平均值±s.e.m.。单因素方差分析。(e)、(f)，用抗外显子21(e)或抗外显子16(f)免疫沉淀的10周龄小鼠心脏溶解物，然后进行sds-page和考马斯蓝染色。切割约50kd(框)处的条带进行ms分析。(g)、(h)，用抗外显子21(g)或抗外显子16(h)免疫沉淀的小鼠心脏的camkii-δ外显子13-16-17(g)和20-21(h)拼接体匹配的肽的lc-ms/ms谱。上面的肽序列是相应的外显子拼接体，具体的外显子16和21以粗体显示。bn离子是第n个肽键的片段，含有肽的氨基末端部分，而yn离子含有羧基末端部分。nl，归一化强度水平(每秒计数)。(i)、(j)，在恒河猴(i)和wt小鼠(j)中的camkii-δ9组织分布。n＝4个生物独立样本。camkii-δ9重组蛋白充当阳性对照(pc)。在这两个物种中，在脑中检测到分子量较高的条带，这是脑富集的剪接变体camkii-δ1(外显子13-15-16-17)。(k)、(l)，内源性camkii-δ9(灰色)在成年(左)和新生(右)大鼠心室心肌细胞中的胞质位置(k,n＝4个生物独立样本)，以及ha-camkii-δ3(灰色)在感染了ad-ha-camkii-δ3的nrvm中的核位置(l,n＝6个生物独立样本)的免疫荧光共聚焦显微图像。比例尺，10μm。(m)，nrvm的细胞核和胞质部分的camkii-9蛋白水平。n＝6个生物独立样本。49.图11说明camkii-δ9在心脏中的病理相关性。(a)、(b)，蛋白质印迹，显示经过或未经dox处理(1μm，30和60分钟)的nrvm中camkii-δ9的磷酸化(a，n＝8个生物独立样本)和氧化(b，n＝7个生物独立样本)水平。nrvm用ad-flag-camkii-δ9感染，溶解物用flag抗体免疫沉淀并进行蛋白质印迹分析。(c)、(d)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示有或没有i/r损伤的灌注小鼠心脏(30分钟局部缺血，然后60分钟再灌注)中camkii-δ9的磷酸化(c)和氧化(d)水平。n＝6个生物独立样本。心脏溶解物用外显子16抗体免疫沉淀并进行蛋白质印迹分析。(e)，camkii-δ9sirna的序列。黑色序列是camkii-δ9的外显子16中的sirna目标。sirna序列在下方以灰色显示。(f)、(g)，由mrna(f，n＝5个(加扰),和8个(camkii-δ9sirna)生物独立样本)和蛋白质(g，n＝3个生物独立样本)水平证实的camkii-δ9sirna的敲低效率。(h)，通过实时pcr分析的感染了加扰或camkii-δ9sirna的nrvm中camkii-δ2和camkii-δ3的mrna水平的平均数据。n＝18个(camkii-δ2)和15个(camkii-δ3)生物独立样本。(i)、(j)，在存在或不存在h2o2(200μm)(i)或dox(1μm)(j)的情况下，在用加扰或camkii-δ9sirna处理的nrvm的培养基中，通过ldh浓度评估的细胞活力。n＝6个生物独立样本。(k)，通过在以指定moi感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ9和ad-camkii-δ248小时的nrvm的培养基中的ldh评估的活力。n＝10个生物独立样本。(l)，感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ9或ad-camkii-δ2(moi 50，48小时)的nrvm中camkii-δ表达的代表性蛋白质印迹和统计数据。n＝3个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析(a、b、g、k)，双侧学生t检验(c、d、f、h、l)或双因素方差分析(i、j)。50.图12说明对camkii-δ9和camkii-δ2的基因表达谱的rna-seq分析。(a)，基于ad-β-gal和ad-camkii-δ9之间差异表达的基因，表示感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ9或ad-camkii-δ2(moi 50，48小时)的nrvm中的基因表达特征的热图。每个基因的表达值以每百万定位片段每千碱基转录物的片段(fpkm)计算。列出了七十七个基因；相对于感染了ad-β-gal的细胞，它们在感染了ad-camkii-δ9的细胞中发生了有差异地显著变化(》1.5倍或《0.67倍，n＝3个生物独立样本)。在ad-camkii-δ9和ad-camkii-δ2中受到不同调控的15个基因为灰色。热图由r软件包“pheatmap”生成，选项为“scale＝row”，这意味着每个基因的表达值是由fpkm值归一化的z-score。(b)，在感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ9或ad-camkii-δ2(moi 50，48小时)的nrvm中，通过实时pcr分析的由rna-seq鉴定的受camkii-δ9而非camkii-δ2调节的15个基因中12个的mrna水平数据。n＝14个生物独立样本。(c)、(d)，在所培养的感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ9或ad-camkii-δ2(如所指示的剂量，48小时)中，cox-2(c)和pai-2(d)的蛋白水平。n＝4个生物独立样本。(e)，典型的蛋白质印迹和平均数据，显示用加扰或cox-2sirna转染的nrvm中cox-2的蛋白水平。n＝4个生物独立样本。(f)、(g)，在存在或不存在cox-2sirna的情况下，感染了ad-β-gal或ad-camkii-δ9的nrvm中，由胱天蛋白酶3/7活性(f)和培养基中的ldh浓度(g)所指示的细胞活力。n＝3个(f)和6个(g)生物独立样本。(h)，代表性蛋白质印迹和平均数据，显示用加扰或ube2t sirna转染的nrvm中ube2t的蛋白水平。n＝4个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析(b、c、d、e、h)或双因素方差分析(f、g)。51.图13说明camkii-δ9诱发心肌细胞dna损伤。(a)、(b)，在感染了ad-β-gal、ad-camkii-δ2或ad-camkii-δ9(moi 50，48小时)的nrvm中，γ-h2ax的完整代表性免疫染色(a)和彗星分析法(b)。比例尺，20μm。部分代表图像和平均数据显示在图3a、c中。(c-f)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示感染了加扰、fancd2或fanci sirna的nrvm中fancd2(c，n＝4个生物独立样本)和fanci(d，n＝4个生物独立样本)的水平以及胱天蛋白酶3/7活性(e、f，n＝5个生物独立样本)。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析。52.图14说明camkii-δ9-ube2t信号传导在心脏病理生理学中的作用。(a)，camkii-δ9tg小鼠的构建示意图。(b)，wt和camkii-δ9tg小鼠的pcr基因分型。(c)、(d)，10周龄wt和camkii-δ9tg小鼠的心脏重量与体重之比(c，n＝15个(wt)和9个(camkii-δ9tg)生物独立样本)和心室基因表达(d，n＝7个(wt)和6个(camkii-δ9tg)生物独立样本)。(e)，10周龄wt和camkii-δ9tg小鼠心脏γ-h2ax的免疫染色。箭头，γ-h2ax阳性细胞。右侧窗口，如所指示的视图的放大图像。平均数据在图4g中。比例尺，20μm。(f)，camkii-δ9shrna转基因(shrna tg)小鼠的构建示意图。(g)，wt和shrna tg小鼠的pcr基因分型。(h)，10周龄wt和shrna tg小鼠的心脏外显子21蛋白水平(n＝4个生物独立样本)。(i)、(j)，tac手术后4周wt和shrna tg小鼠的心脏重量与体重之比(i，n＝16个(wt)和8个(shrna tg)生物独立样本)和心脏ube2t蛋白水平(j，n＝4个生物独立样本)。(k)，10周龄camkii-δ9tg和camkii-δ2tg小鼠的心脏camkii-δ蛋白水平(n＝4个生物独立样本)。(l-q)，wt、camkii-δ9tg和camkii-δ2tg小鼠的心脏tunel染色(l，n＝8个生物独立样本)、超声心动图(m，n＝8个生物独立样本)、心脏重量与体重之比(n，n＝8个生物独立样本)、kaplan-meier生存曲线(o，n＝10个(wt)、19个(camkii-δ9tg)和12个(camkii-δ2tg)生物独立样本)、心脏γ-h2ax染色(p，n＝8个生物独立样本)以及心脏ube2t蛋白水平(q，n＝4个生物独立样本)。数据为平均值±s.e.m.。双侧学生t检验(c、d、i)、单因素方差分析(k-n、p、q)、双因素方差分析(j)或对数秩(mantel-cox)检验(o)。53.图15说明camkii-δ9使ube2t在ser110位点处磷酸化。(a)，质谱数据，显示由camkii-δ9介导的ube2t的两个潜在磷酸化位点(ser110和ser193，圆圈)(n＝3个生物独立样本)。hek293细胞在对照载体或或带flag标签的camkii-δ9存在下用带myc标签的ube2t转染，全细胞溶解物用myc抗体免疫沉淀，然后对免疫复合物进行翻译后修饰质谱分析。(b)，ube2t蛋白的序列比对，显示12个物种中ube2t的ser110位点而非ser193位点(箭头)的保守性。(c)，典型的蛋白质印迹和平均数据，显示在无细胞系统中，在与或不与camkii-δ9蛋白共培育的情况下ube2t和ube2t-s110a重组蛋白的丝氨酸磷酸化和总水平(n＝4个生物独立样本)。双因素方差分析。(d)，在感染了ad-ube2t、ad-ube2t-s110a或ad-ube2t-s193a的nrvm中，wt ube2t、ube2t-s110a和ube2t-s193a(均带有myc标签)的代表性免疫荧光图像(n＝6个生物独立样本)。注意，ube2t-s110a是抗降解的，并且分布在细胞质和细胞核中，表明ube2t的ser110位点负责其降解，而不是其亚细胞分布，比例尺，10μm。数据为平均值±s.e.m.。54.图16说明由camkii-δ外显子拼接体编码的肽与ube2t之间的相互作用。(a-c)，在用相应外显子拼接体(带flag-gfp标签)或ube2t-myc的质粒转染的hek293细胞中，camkii-δ外显子拼接体外显子13-17(a)、13-14-17(b)和13-15-16-17(c)编码的肽与ube2t的免疫共沉淀。(n＝4个生物独立样本)。55.图17说明camkii-δ基因的外显子16的氨基酸序列(seq id no:1)、camkii-δ基因的外显子13-16的氨基酸序列(seq id no:2)、camkii-δ基因的外显子16-17的氨基酸序列(seq id no:3)、camkii-δ基因的外显子13-16-17的氨基酸序列(seq id no:4)和camkii-δ9的全长氨基酸序列(seq id no:5)。56.图18说明人和大鼠camkii-δ基因外显子16的核酸序列(seq id no:6)、小鼠camkii-δ基因外显子16的核酸序列(seq id no:7)、人camkii-δ基因外显子13-16的核酸序列(seq id no:8)、大鼠camkii-δ基因外显子13-16的核酸序列(seq id no:9)、小鼠camkii-δ基因外显子13-16的核酸序列(seq id no:10)、人camkii-δ基因外显子16-17的核酸序列(seq id no:11)、大鼠camkii-δ基因外显子16-17的核酸序列(seq id no:12)、小鼠camkii-δ基因外显子16-17的核酸序列(seq id no:13)、人camkii-δ基因外显子13-16-17的核酸序列(seq id no:14)、大鼠camkii-δ基因外显子13-16-17的核酸序列(seq id no:15)、小鼠camkii-δ基因外显子13-16-17的核酸序列(seq id no:16)。57.图19说明全长人camkii-δ9的核酸序列(seq id no:17)。58.图20说明全长大鼠camkii-δ9的核酸序列(seq id no:18)。59.图21说明全长小鼠camkii-δ9的核酸序列(seq id no:19)。具体实施方式60.在更详细地描述本发明之前，应理解本公开内容不限于所描述的特定实施方式，因此，当然可能会有变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值，到下限单位的十分之一，以及该规定范围内的任何其他规定值或中间值，都涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也涵盖在本发明内，受规定范围中任何具体排除的限制。当规定范围包括一个或两个限制时，不包括这些所包括的限制中的任何一个或两个的范围也包括在本发明中。61.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。singleton等人,dictionary ofmicrobiology and molecular biology第2版,j.wiley&sons(new york,n.y.1994)和march,advanced organic chemistry reactions,mechanisms and structure第4版,johnwiley&sons(new york,n.y.1992)为本领域的技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般指南。尽管任何与本文所述相似或等效的方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。62.本说明书中引用的所有出版物和专利在此通过引用并入，就像每个单独的出版物或专利被具体和单独指明为通过引用并入一样，并且通过引用并入以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日期之前的公开内容，不应理解为承认本发明无权因在先公开而早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立确认。63.如本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见的是，本文所描述和说明的各个实施方式中的每一个都具有离散的组件和特征，这些组件和特征可以容易地与其他几个实施方式中的任何一个的特征分离或组合，而不偏离本发明的范围或精神。任何叙述的方法都可以按照所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。64.除非另外指明，否则本发明的实施方式将采用化学、固态化学、无机化学、有机化学、物理化学、分析化学、材料化学、生物化学、生物学、分子生物学、重组dna技术、药理学、影像学等技术，这些技术属于本领域的技能。这些技术在文献中得到了充分的解释，如“分子克隆：实验室手册(molecular cloning:alaboratory manual)”，第二版(sambrook等人,1989)；“寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)”(m.j.gait编,1984)；“动物细胞培养(animal cell culture)”(r.i.freshney编,1987)；“酶学方法(methods in enzymology)”系列(academic press,inc.)；“现代分子生物学实验技术(current protocols in molecular biology)”(f.m.ausubel等人编,1987，并定期更新)；“pcr：聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)”(mullis等人编,1994)。本发明采用的引物、多核苷酸和多肽可以使用本领域已知的标准技术产生。65.提出以下实施方式是为了向本领域的技术人员提供关于如何执行本文公开和要求保护的方法和使用生物标志物和试剂盒的完整公开和描述。已努力确保数字(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑到一些误差和偏差。66.必须指出，除非上下文另外明确规定，否则如说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括其复数形式。因此，举例来说，提及“一种化合物”包括多种化合物。在本说明书和所附权利要求书中，将提到一些术语，这些术语应被定义为具有以下含义，除非有明显的相反意图。67.在一个方面，本发明公开了治疗或预防受试者的camkii介导的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的camkii-δ9拮抗剂。在另一个方面，本发明公开了camkii-δ9拮抗剂在制造用于治疗或预防受试者的camkii介导的疾病的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了一种camkii-δ9拮抗剂，其用于治疗或预防受试者的camkii介导的疾病。68.如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指试图改变所治疗的受试者的疾病、病况或病症的自然进程的临床干预，并且可以为预防或在临床病理过程中进行。治疗的理想效果包括预防疾病、病况或病症的发生或复发，减轻症状，减少疾病、病况或病症的任何直接或间接病理后果，降低疾病、病况或病症的进展速度，改善或缓解疾病状态，以及缓解或改善预后。69.如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指降低受试者罹患疾病、病况或病症的概率，所述受试者尚未罹患疾病、病况或病症，但有风险或容易罹患疾病、病况或病症。70.如本文所用，术语“camkii介导的疾病”是指与camkii的异常水平和/或活性有关的疾病、病况或病症，由于受试者体内camkii的异常激活或破坏使得camkii的水平和/或活性异常高或低而导致或促进。在一些实施方式中，camkii介导的疾病与camkii-δ9的水平和/或活性增加有关。在一些实施方式中，camkii介导的疾病是心脏类疾病或代谢类疾病。在一些实施方式中，心脏类疾病选自由以下组成的组：心肌病、心肌炎、糖尿病性心脏病、心肌缺血、心脏缺血/再灌注损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂、心绞痛、心脏肥大、心脏损伤、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心绞痛、心肌炎、冠心病和心包炎。在一些实施方式中，心脏类疾病是肥厚型心肌病。在一些实施方式中，代谢类疾病选自由以下组成的组：胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病、高血压、血脂异常、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖症、高血脂症、痛风和高尿酸血症。71.如本文所用，术语“施用(administer/administering/administered/administration)”是指将物质递送给有需要的受试者。施用途径可以是局部、口服、鼻内、肠胃外、肠内、直肠、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌内、经颊、舌下或眼部。在一些实施方式中，物质可以通过静脉内、腹膜内或皮下注射，使用外周全身递送施用于受试者。72.如本文所用，术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物。“受试者”还可以是家畜，如牛、猪、羊、家禽和马；或啮齿动物，如大鼠、小鼠；或非人灵长类动物，如猿、猴、恒河猴；或家养动物，如狗或猫。术语“受试者”在任何方面都不以限制为目的，可以是任何年龄、性别和身体状况，例如可以是男性或女性，可以是老年人、成年人、青少年、儿童或婴儿。人类“受试者”可以是白种人、非洲人、亚洲人、闪米特人或其他种族，或上述种族背景的混血儿。在一些实施方式中，受试者是人类或非人灵长类动物。在一些实施方式中，非人灵长类动物是恒河猴。在一些实施方式中，受试者是人。73.如本文所用，术语“有效量”是指通过抑制或减轻受试者的疾病、病况或病症，或通过预防性地抑制或预防疾病、病症或症状的发作而达到治疗效果或预防效果的药剂量。有效量可以是在一定程度上缓解受试者疾病或病症的一个或多个症状的药剂量；使与疾病或病症相关或导致疾病或病症的一个或多个生理或生化参数部分或完全恢复正常；和/或减少疾病或病症发作的可能性。本领域熟练的临床医生可以确定药剂的有效量，以便在施用时治疗或预防特定疾病或病症。有效所需的精确药剂量将取决于许多因素，例如活性物质的比活性、采用的递送装置、物质的物理特性、施用目的以及许多患者的具体考虑。确定作为有效量必须施用的药剂量是本领域的常规做法，属于普通熟练的临床医生的技能范围。74.如本文所用，术语“拮抗剂”是指抑制蛋白质、多肽或肽的表达水平或活性的分子，从而减少蛋白质、多肽或肽的数量、形成、功能和/或下游信号传导。例如，本发明的“camkii-δ9的拮抗剂”是指抑制camkii-δ9的表达水平或活性的分子，从而减少camkii-δ9的数量、形成、功能和/或下游信号传导。75.如果分子导致camkii-δ9的表达(无论是在转录或翻译水平)水平或活性显著降低，则认为该分子抑制了camkii-δ9的表达水平或活性。同样，如果分子导致camkii-δ9与其底物之间的结合显著减少，从而导致由camkii-δ9介导的下游信号传导和功能显著减少(例如，泛素结合酶的磷酸化减少)，则认为该分子抑制了camkii-δ9与其底物之间的结合。例如，如果减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，则认为减少是显著的。76.结合拮抗剂可以两种方式起作用。在一些实施方式中，本发明的结合拮抗剂可以与camkii-δ9竞争结合其底物，从而干扰、阻断或以其他方式阻止camkii-δ9与其底物的结合。这种类型的拮抗剂，与底物结合但不触发预期的信号转导，也被称为“竞争性拮抗剂”，可以包括例如表达无磷酸化或无氧化功能的camkii-δ9的载体。在其他实施方式中，本发明的结合拮抗剂可以足够的亲和力和特异性结合和螯合camkii-δ9，以基本上干扰、阻断或以其他方式阻止camkii-δ9与其底物的结合。这种类型的拮抗剂也被称为“中和拮抗剂”，可以包括例如针对camkii-δ9的抗体或适体，其与camkii-δ9特异性结合。77.在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制泛素结合酶磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，泛素结合酶是ube2t。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制ube2t在ser110处磷酸化的拮抗剂。78.泛素化通过泛素蛋白酶体系统调节细胞蛋白质的降解，控制蛋白质的半衰期和表达水平。这个过程涉及泛素激活酶(e1)、泛素结合酶(e2)和泛素连接酶(e3)的顺序作用。泛素结合酶执行泛素化反应的第二步，靶向通过蛋白酶体降解的蛋白质。磷酸化是一种生化反应，其中磷酸基团被添加到蛋白质的丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)或酪氨酸(tyr)残基上，并由蛋白激酶催化。例如，camkii-δ9在ser110处将ube2t磷酸化。磷酸化通常会修改目标蛋白的功能，往往会引起激活。作为细胞稳态机制的一部分，磷酸化只是一个短暂的过程，会被其他称为磷酸酶的酶逆转。因此，蛋白质磷酸化水平随着时间的推移而变化，并且可以通过许多众所周知的方式进行评估，包括例如通过免疫学方法。例如，磷酸化的ube2t的量可通过免疫分析法确定，该方法使用的试剂可与磷酸化ube2t特异性结合。这种免疫分析法可以具有许多众所周知的形式，包括但不限于放射免疫分析法、蛋白质印迹分析法、免疫荧光分析法、酶免疫分析法、免疫沉淀分析法、化学发光分析法、免疫组织化学分析法、斑点印迹分析法或狭缝印迹分析法。79.在一些实施方式中，酶免疫分析法是夹心酶免疫分析法，使用与ube2t特异性结合的捕获抗体或其片段和与磷酸化ube2t特异性结合的检测抗体或其片段。这种酶免疫分析法是特别有利的，因为鉴定相关激酶家族成员或同种型之间的蛋白质水平差异给出了激酶本身之间以及它们的磷酸化形式之间相对高的同源性。80.用于鉴定磷酸化和非磷酸化形式的ube2t以及检测camkii-δ9的免疫试剂是本领域中众所周知的，可以使用标准技术产生，例如用适当的ube2t片段接种宿主动物，产生针对camkii-δ9、ube2t和/或磷酸化ube2t的抗体(例如单克隆抗体)。此类抗camkii-δ9、抗ube2t和/或抗磷酸化ube2t抗体试剂可用于分离和/或确定各自蛋白质的量，如在细胞溶解物中。此类试剂也可用于监测细胞或组织例如白血球或淋巴细胞中的蛋白质水平，作为临床测试程序的一部分，例如为了监测抑制性药剂的最佳剂量。通过将抗体与可检测物质偶联(例如，物理连接)可以促进检测。可检测物质的实施例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实施例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实施例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实施例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实施例包括鲁米诺；生物发光材料的实施例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，以及合适的放射性材料的实施例包括125i、131i、35s或3h。81.在一些实施方式中，拮抗剂是camkii-δ9的特异性拮抗剂。82.如本文所用，术语“特异性拮抗剂”是指拮抗剂不应显著抑制除camkii-δ9以外的任何肽、多肽或物质。在一些实施方式中，特异性拮抗剂对camkii-δ9的抑制作用应比对任何其他相关肽或多肽的抑制作用至少高3倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。例如，拮抗剂对camkii-δ9的抑制作用比对camkii-δ2或camkii-δ3的抑制作用至少高3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍。在一些实施方式中，拮抗剂抑制camkii-δ9的水平或活性，但不显著抑制camkii-δ2或camkii-δ3的水平或活性。如本文所用，术语“显著”是指统计学上显著的差异，或本领域技术人员可以识别的显著差异。83.在一些实施方式中，拮抗剂是特异性识别camkii-δ9的抗体。84.除非本文另有说明，否则术语“抗体(antibody/antibodies)”广泛地涵盖天然存在形式的抗体(例如igg、iga、igm、ige)和重组抗体，如单链抗体、嵌合和人源化抗体和多特异性抗体，以及所有前述的片段和衍生物，所述片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体结合的蛋白质或化学部分。85.如本文所用，术语“抗体”还包括抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)。如本文所用，术语“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如，生物标志物多肽或其片段)特异性结合的能力。已经证明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实施例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含两个在铰链区通过二硫桥键连接的fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)dab片段(ward等人,(1989)nature341:544-546)，其由vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，使得它们能够作为单个蛋白质链形成，其中vl和vh区配对形成单价多肽(称为单链fv(scfv)；参见例如bird等人(1988)science 242:423-426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；和osbourn等人1998,naturebiotechnology 16:778)。此类单链抗体也意图涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。特定scfv的任何vh和vl核酸序列可以与人类免疫球蛋白恒定区cdna或基因组序列连接，以产生编码完整igg多肽或其他同型的表达载体。vh和vl也可用于使用蛋白质化学或重组dna技术产生fab、fv或其他免疫球蛋白片段。还涵盖其他形式的单链抗体，如双功能抗体。双功能抗体是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如holliger,p.等人,(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448；poljak,r.j.等人,(1994)structure 2:1121-1123)。86.更进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是较大免疫粘附多肽的一部分，通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成。此类免疫粘附多肽的实施例包括使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scfv多肽(kipriyanov,s.m.等人,(1995)humanantibodies andhybridomas 6:93-101)和使用半胱氨酸残基、生物标志物肽和c端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scfv多肽(kipriyanov,s.m.等人,(1994)mol.immunol.31:1047-1058)。抗体部分，如fab和f(ab')2片段，可以使用常规技术由全抗体制备，如分别对全抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附多肽可以使用标准重组dna技术获得，如本文所述。87.抗体可以是多克隆的或单克隆的；异基因的、同种异基因的或同基因的；或其修饰形式(例如人源化的、嵌合的等)。抗体也可以是全人的。在一些实施方式中，本发明的抗体与camkii-δ9或其片段特异性或基本上特异性结合。88.如本文所用，术语“单克隆抗体(monoclonal antibodies/monoclonal antibody)”是指仅含有一种能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点的抗体多肽群，而术语“多克隆抗体(polyclonal antibodies/polyclonal antibody)”是指含有多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体多肽群。单克隆抗体通常对与其免疫反应的特定抗原显示单一的结合亲和力。在一些实施方式中，单克隆抗体通常包括包含结合目标的多肽序列的抗体，其中目标结合多肽序列是通过包括从多个多肽序列中选择单个目标结合多肽序列的过程获得。例如，选择过程可以是从多个克隆如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组dna克隆的池中选择独特的克隆。应理解，可以进一步改变选定的目标结合序列，例如提高对目标的亲和力，使目标结合序列人源化，提高其在细胞培养物中的产量，降低其在体内的免疫原性，创造多特异性抗体等，并且包含改变的目标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。为了筛选与感兴趣的抗体所结合的抗原上的表位结合的抗体，可以进行常规的交叉阻断分析法，如antibodies,a laboratorymanual,cold spring harbor laboratory,ed harlow和david lane(1988)中所述。89.抗体也可以是“人源化的”，其意在包括由非人细胞制备的抗体，其可变区和恒定区已经被改变以更接近于由人细胞制备的抗体。例如，通过改变非人抗体氨基酸序列以并入人种系免疫球蛋白序列中发现的氨基酸。本发明的人源化抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在cdr中。如本文所用，术语“人源化抗体”还包括其中来源于另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的cdr序列已经移植到人构架序列上的抗体。90.如本文所用，术语“特异性识别”是指抗体不应与另一种肽、多肽或物质发生实质性结合(“交叉反应”)。在一些实施方式中，特异性识别的肽或多肽应以比任何其他相关肽或多肽高至少3倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍的亲和力结合。例如，拮抗剂与camkii-δ9特异性结合，其亲和力比camkii-δ2或camkii-δ3至少高3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍。在一些实施方式中，拮抗剂抑制camkii-δ9的活性，但不显著抑制camkii-δ2或camkii-δ3的活性。91.如本文所用，术语“抑制(inhibit/inhibiting/inhibition)”是指生物活动或过程的基线活性的降低。“抑制camkii-δ9的活性”是指相对于不存在本发明的拮抗剂时camkii-δ9的水平或活性，作为对本发明的拮抗剂存在的直接或间接反应，camkii-δ9的水平或活性下降。在一些实施方式中，camkii-δ9的活性包括camkii-δ9的磷酸化和/或氧化活性，这可以由本领域的技术人员测量。92.在一些实施方式中，抗体与camkii-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列结合。在一些实施方式中，抗体与camkii-δ基因的外显子13-16编码的氨基酸序列结合。在一些实施方式中，抗体与camkii-δ基因的外显子16-17编码的氨基酸序列结合。在一些实施方式中，抗体与camkii-δ基因的外显子13-16-17编码的氨基酸序列结合。在一些实施方式中，抗体与全长camkii-δ9的氨基酸序列结合。93.如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上，是指可以并入多肽链的任何化合物和/或物质，例如通过形成一个或多个肽键。在一些实施方式中，氨基酸具有通用结构h2n-c(h)(r)-cooh。在一些实施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是l-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是标准氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是非标准氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是以合成方式制备还是从天然来源获得。在一些实施方式中，氨基酸，包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，与上述通用结构相比，可以含有结构修饰。例如，在一些实施方式中，与通用结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或取代而被修饰。在一些实施方式中，与含有其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，此类修饰可以例如改变含有修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方式中，与含有其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，此类修饰不会显著改变含有修饰氨基酸的多肽的相关活性。从上下文可以看出，在一些实施方式中，术语“氨基酸”用于指游离氨基酸；在一些实施方式中，它用于指多肽的氨基酸残基。氨基酸的名称在本公开中也以标准的单字母或三字母代码表示，其概述如下。94.名称三字母代码单字母代码丙氨酸alaa精氨酸argr天冬酰胺asnn天冬氨酸aspd半胱氨酸cysc谷氨酸glue谷氨酰胺glnq甘氨酸glyg组氨酸hish异亮氨酸ilei亮氨酸leul赖氨酸lysk甲硫氨酸metm苯丙氨酸phef脯氨酸prop丝氨酸sers苏氨酸thrt色氨酸trpw酪氨酸tyry缬氨酸valv95.如本文所用，术语“编码(encoded/encoding)”是指能够转录成mrna和/或翻译成肽或蛋白质。术语“编码序列”或“基因”是指编码肽或蛋白质的多核苷酸序列。这两个术语在本发明中可以互换使用。在一些实施方式中，编码序列是由信使rna(mrna)逆转录的互补dna(cdna)序列。在一些实施方式中，编码序列是mrna。96.在一些实施方式中，camkii-δ基因的外显子16、外显子13-16、外显子16-17和外显子13-16-17，以及全长camkii-δ9的核酸序列包含与如seq id no:6-19所示的任何一个核酸序列具有至少70％同源性，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的核酸序列，并且仍然可以编码如seq id no:1-5所示的氨基酸序列之一。97.在一些实施方式中，camkii-δ9具有如seq id no:1-5所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，camkii-δ9的编码序列具有如seq id no:6-19所示的核酸序列。在一些实施方式中，本发明提供了编码seq id no:1-5的核酸序列，但由于遗传密码的简并性，它们与如seq id no:6-19所示的任何一个核酸序列不同。98.如本文所用，术语“遗传密码的简并性”是指一个氨基酸具有两个或更多个相应的遗传密码子的现象。例如，脯氨酸具有4个同义密码子ccu、ccc、cca和ccg。本领域众所周知，由于遗传密码的简并性，有可能在不改变编码的氨基酸序列的情况下替换给定核酸序列中某些位置的核酸。对于本领域的技术人员来说，通过例如碱基的定点诱变来进行遗传密码的简并性的替换是微不足道的。不同的生物体对不同的密码子产生不同的偏好。为了在选定的生物细胞中表达本发明的多肽，可以选择生物细胞的优选密码子来获得相应的编码序列，并且可以通过重组表达获得本发明的氨基酸序列(例如seq id no:1-5)。99.在一些实施方式中，拮抗剂是与camkii-δ9结合的小分子化合物。100.如本文所用，术语“小分子化合物”是指可充当酶底物或生物过程调节剂的低分子量化合物。一般来说，“小分子化合物”是大小小于约5千道尔顿(kd)的分子。在一些实施方式中，小分子小于约4kd、3kd、约2kd或约1kd。在一些实施方式中，小分子小于约800道尔顿(d)、约600d、约500d、约400d、约300d、约200d或约100d。在一些实施方式中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、小于约800g/mol或小于约500g/mol。在一些实施方式中，小分子是非聚合的。在一些实施方式中，根据本发明，小分子不是蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、多糖、糖蛋白、蛋白聚糖等。在一些实施方式中，小分子是治疗剂。在一些实施方式中，小分子是佐剂。在一些实施方式中，小分子是药物。101.在一些实施方式中，拮抗剂是靶向camkii-δ9的编码序列的rnai(rna干扰)分子或靶向camkii-δ9的编码序列的反义核苷酸。在一些实施方式中，rnai分子是小干扰rna(sirna)、小发夹rna(shrna)或微小rna(mirna)。102.本发明的rnai可以包括一种或多于一种类型的对camkii-δ9具有特异性的核酸分子。例如，仅一种类型的sirna可用于下调camkii-δ9；两种类型的sirna(例如，具有不同的序列)可组合使用以调节camkii-δ9的表达水平；反义寡核苷酸可与sirna组合以降低camkii-δ9的水平。103.本发明的rnai在各种水平，如转录后水平、转录前水平或表观遗传水平下调camkii-δ9。在一个非限制性实施例中，本发明的rnai分子对基因表达的表观遗传调控可以由rnai介导的染色质结构的修饰来改变基因表达引起(参见例如verdel等人,2004,science,303,672-676；pal-bhadra等人,2004,science,303,669-672；allshire,2002,science,297,1818-1819；volpe等人,2002,science,297,1833-1837；jenuwein,2002,science,297,2215-2218；和hall等人,2002,science,297,2232-2237)。104.本发明的rnai分子可以是双链或单链的。当rnai为双链时，一条链为有义链，另一条为反义链；反义链包含与camkii-δ9的编码序列或其一部分互补的核苷酸序列，有义链包含与camkii-δ9的编码序列或其一部分对应的核苷酸序列。或者，rnai分子由单个寡核苷酸组装而成，其中rnai分子的自互补有义和反义区域通过基于核酸或基于非核酸的接头连接。rnai分子可以是具有双螺旋体、不对称双螺旋体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸。rnai可以是环状单链多核苷酸，其具有两个或更多个环结构和包含自互补有义和反义区的茎。环状多核苷酸可以在体内或体外进行处理，以产生活性rnai分子。105.在一些实施方式中，rnai分子具有10-100个碱基，例如可以具有约10至约100个碱基、约15至约90个碱基、约20至约80个碱基、约25至约70个碱基、约30至约60个碱基、约35至约50个碱基的长度。106.小干扰rna(sirna)是一种双链rna分子，其能够抑制或减少与之同源的基因的表达。sirna的每条链可以具有约10至约100个碱基、约15至约90个碱基、约20至约80个碱基、约25至约70个碱基、约30至约60个碱基、约35至约50个碱基的长度。双链sirna可以具有约10至约50个碱基对、约12至约45个碱基对、约15至约40个碱基对、约20至约35个碱基对、约20至约30个碱基对或约20至约25个碱基对。107.小发夹rna(shrna)是具有紧密发夹弯的人工rna分子，其可用于通过rna干扰使目标基因表达沉默。在一些实施方式中，shrna在细胞中的表达是通过质粒的递送或通过病毒或细菌载体来实现。shrna通常具有约10至约100个碱基对的长度，例如约10至约100个碱基对、约15至约90个碱基对、约20至约80个碱基对、约25至约70个碱基对、约30至约60个碱基对或约35至约50个碱基对的长度。108.微小rna(mirna)是一类小的非编码rna，其通过降解其目标mrna和/或抑制其翻译，在转录后水平参与基因表达的调节。mirna通常具有约10至100个碱基的长度，例如约10至约100个碱基、约15至约90个碱基、约20至约80个碱基、约25至约70个碱基、约30至约60个碱基或约35至约50个碱基的长度。109.如本文所用，术语“反义核苷酸”是指能够通过氢键与目标核酸杂交的寡聚化合物。例如，“靶向camkii-δ9的编码序列的反义核苷酸”是指能够与camkii-δ9的编码序列或其一部分杂交的核苷酸。110.在一些实施方式中，反义核苷酸可经修饰以提高其稳定性。对反义核苷酸的修饰包括对核苷间键、糖部分或核碱基的取代或改变。经修饰的反义核苷酸通常优于原生形式，因为具有期望的特性，如增强细胞吸收，增强对核酸目标的亲和力，在核酸酶存在的情况下增加稳定性，或增加抑制活性。111.在一些实施方式中，rnai分子或反义核苷酸与camkii-δ基因的外显子16互补。在一些实施方式中，rnai分子或反义核苷酸与camkii-δ基因的外显子13-16互补。在一些实施方式中，rnai分子或反义核苷酸与camkii-δ基因的外显子16-17互补。在一些实施方式中，rnai分子或反义核苷酸与camkii-δ基因的外显子13-17互补。在一些实施方式中，rnai分子或反义核苷酸与全长camkii-δ9的编码序列互补。112.如本文所用，术语“互补”或“互补性”是指第一核酸和第二核酸的核碱基之间配对的能力。在一些实施方式中，本文提供的rnai分子或反义核苷酸与目标核酸至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补，其中目标核酸选自由以下组成的组：camkii-δ基因的外显子16、camkii-δ基因的外显子13-16、camkii-δ基因的外显子16-17、camkii-δ基因的外显子13-17和全长camkii-δ9的编码序列。rnai分子或反义核苷酸与目标核酸的互补性百分比可以使用本领域的常规方法确定。113.在一些实施方式中，拮抗剂是与camkii-δ9竞争结合其底物的药剂。114.如本文所用，术语“竞争”或“与……竞争”是指药剂通过与camkii-δ9竞争结合其底物而部分或完全抑制其作用。抑制camkii-δ9与其底物的结合减少或改变了camkii-δ9与其底物结合而没有这种抑制时发生的细胞信号传导的正常水平或类型。抑制还意在包括当本文公开的拮抗剂与未接触拮抗剂的camkii-δ9相比，camkii-δ9与其底物的结合的任何可测量的减少，例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。115.在一些实施方式中，与camkii-δ9竞争结合其底物的药剂是表达无磷酸化或无氧化功能的camkii-δ9的载体。在一些实施方式中，本发明的载体可以是本领域已知的任何基因转移载体。在一些实施方式中，本发明的载体可以包含外源基因，所述外源基因包含camkii-δ9的编码基因、基本上由其组成或由其组成。在一些实施方式中，本文提供的载体所表达的camkii-δ9没有磷酸化或氧化功能，因为负责camkii-δ9的磷酸化或氧化功能的编码基因被突变、沉默或删除。在一些实施方式中，本文提供的载体所表达的camkii-δ9没有磷酸化或氧化功能，因为它经历了翻译后处理，使其磷酸化或氧化功能被消除。在一些实施方式中，载体是腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或质粒。116.aav是细小病毒科的成员并且包含小于约5,000个核苷酸的线性单链dna基因组。aav需要与辅助病毒(即腺病毒或疱疹病毒)共同感染，或表达辅助基因，才能有效复制。用于施用治疗性核酸的aav载体通常缺失大约96％的亲本基因组，从而仅保留了末端重复序列(itr)，其含有用于dna复制和包装的识别信号。这消除了由于病毒基因的表达而产生的免疫学或毒副作用。此外，如果需要，将特定的aav蛋白递送到生产细胞中能够将包含aav itr的aav载体整合到细胞基因组的特定区域中(参见例如美国专利6,342,390和6,821,511)。包含整合的aav基因组的宿主细胞在细胞生长或形态上没有变化(参见例如美国专利4,797,368)。117.aav载体可以使用本领域中已知的任何aav血清型产生。数种aav血清型和超过100种aav变体已经从腺病毒储备液或从人类或非人灵长类动物组织中分离出来(综述于例如wu等人,molecular therapy,14(3):316-327(2006))。一般来说，aav血清型的基因组序列在核酸序列和氨基酸序列水平上具有显著的同源性，因此不同的血清型具有一套相同的遗传功能，产生的病毒粒子在物理上和功能上基本等同，并且通过几乎相同的机制进行复制和组装。在一些实施方式中，本发明的aav是aav1、aav2、aav5、aav8、aav9或aavrh10。118.在另一个方面，本发明公开了减轻受试者的心脏损伤的方法，其包括向受试者施用有效量的camkii-δ9拮抗剂。在又一个方面，本发明公开了camkii-δ9拮抗剂在制造用于减轻受试者的心脏损伤的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于减轻受试者的心脏损伤的camkii-δ9拮抗剂。119.如本文所用，术语“减轻(alleviate/alleviating/alleviation)”包括减少、限制或阻断例如特定的作用、功能或相互作用。在一些实施方式中，如果心脏损伤的至少一个症状被终止、减缓或防止，则心脏损伤减轻。在一些实施方式中，如果与参考状态相比，可能导致心脏损伤的蛋白质(例如camkii-δ9)的水平或活性下降，则心脏损伤减轻。这种减轻可以是部分或完全的。120.在另一个方面，本发明公开了刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的方法，其包括向受试者施用有效量的camkii-δ9拮抗剂。在又一个方面，本发明公开了camkii-δ9拮抗剂在制备用于刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的camkii-δ9拮抗剂。“泛素结合酶水平或活性”是指受试者的泛素结合酶的量，或受试者的泛素结合酶在泛素化反应过程中靶向通过蛋白酶体降解的蛋白质的能力。121.在一些实施方式中，将测试生物样本中泛素结合酶的水平或活性与参考样本中泛素结合酶的参考水平或活性进行比较。如本文所用，术语“参考水平或活性”是指受试者体内物质的阈值水平或活性。例如，如果接受camkii-δ9拮抗剂的受试者的测试生物样本中泛素结合酶的水平或活性高于参考样本中泛素结合酶的参考水平或活性，则camkii-δ9拮抗剂可被认为是刺激受试者的泛素结合酶的水平或活性。泛素结合酶的参考水平或活性可以源自一个或多个参考样本，其中参考水平或活性是从与测试感兴趣样本的实验平行进行的实验中获得的。或者，参考水平或活性可以在参考数据库中获得，其中包括来自一个或多个参考样本或疾病参考样本的数据、标准、水平或活性的集合。在一些实施方式中，此类数据、标准、水平或活性的集合被归一化，以便它们可以用于与来自一个或多个样本的数据进行比较。“归一化(normalize/normalization)”是将测量的原始数据转换成可与其他如此归一化的数据直接比较的数据的过程。归一化用于克服由不同分析法之间变化的因素引起的分析法特异性误差，例如加载量的变化、结合效率、检测灵敏度和其他各种误差。在特定实施方式中，参考数据库包括来自一个或多个参考样本的泛素结合酶的浓度和/或其他实验室和临床数据。在一些实施方式中，参考数据库包括泛素结合酶的水平或活性，其各自归一化为在与参考样本相同的条件下测试的参考样本的泛素结合酶的水平或活性(例如泛素结合酶的已知量或活性)的百分比。为了与此类归一化的泛素结合酶的水平或活性进行比较，测试生物样本的泛素结合酶的水平或活性也被测量并计算为在与测试样本相同的条件下测试的参考样本的泛素结合酶的水平或活性的百分比。122.不受任何理论的束缚，但预期受试者的泛素结合酶的水平或活性的增加对受试者有益。在一些实施方式中，在测试生物样本中检测到的泛素结合酶的水平或活性是泛素结合酶的参考水平或活性的至少2倍。在一些实施方式中，在测试生物样本中检测到的泛素结合酶的水平或活性是泛素结合酶的参考水平或活性的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍。123.在一些实施方式中，参考样本来自健康受试者，或者是比测试生物样本更早或更晚从同一受试者获得的样本。124.如本文所用，术语“健康受试者”是指已知或相信不受本发明的方法或组合物用于鉴定的疾病、病况或病症所困扰的受试者。在一些实施方式中，参考样本获自使用本发明的方法或组合物鉴定疾病或病况的同一受试者的身体的健康部分。在一些实施方式中，测试生物样本来自受试者的心脏。在一些实施方式中，受试者是人类或非人灵长类动物。125.在另一个方面，本发明公开了防止受试者的泛素结合酶降解的方法，其包括向受试者施用有效量的camkii-δ9拮抗剂。在又一个方面，本发明公开了camkii-δ9拮抗剂在制造用于防止受试者的泛素结合酶降解的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于防止受试者的泛素结合酶降解的camkii-δ9拮抗剂。126.如本文所用，“泛素结合酶的降解”是指与参考样本中泛素结合酶的参考水平或活性相比，测试生物样本中泛素结合酶的水平或活性降低。不受任何理论的束缚，但预期受试者的泛素结合酶的降解对受试者有害。在一些实施方式中，本文公开的camkii-δ9拮抗剂可以防止例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的测试生物样本中泛素结合酶的量或活性降解。127.在另一个方面，本发明公开了防止样本中心肌细胞死亡的方法，其包括使样本与有效量的camkii-δ9拮抗剂接触。在又一个方面，本发明公开了camkii-δ9拮抗剂在制造用于防止样本中心肌细胞死亡的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于防止样本中心肌细胞死亡的camkii-δ9拮抗剂。在一些实施方式中，本文提供的方法或用途可以防止例如测试样本中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的心肌细胞死亡。128.在另一个方面，本发明公开了减少细胞中dna损伤的方法，其包括使细胞与有效量的camkii-δ9拮抗剂接触。在又一个方面，本发明公开了camkii-δ9拮抗剂在制造用于减少细胞中dna损伤的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于减少细胞中dna损伤的camkii-δ9拮抗剂。如本文所用，术语“dna损伤”是指dna化学结构的改变，如dna链的断裂、dna骨架中的碱基缺失或碱基的化学变化。129.细胞不断暴露于能够造成dna损伤的各种因素，如细胞内反应性物种和环境因子。dna损伤的潜在诱变后果通过dna修复途径最小化，所述途径大致表征为三种形式：碱基切除修复(ber)、错配修复(mmr)和核苷酸切除修复(ner)(wood等人,science,291:1284-1289(2001))。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂可以通过例如抑制细胞中camkii-δ9的水平和/或活性来激活dna修复途径。130.在另一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的camkii介导的疾病的方法，其包括：(a)获得受试者的测试生物样本；和(b)检测测试生物样本中camkii-δ9的水平或活性；其中在受试者的测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性指示受试者罹患camkii介导的疾病或罹患camkii介导的疾病的概率增加。131.在又一个方面，本发明公开了药剂在制造用于诊断受试者的camkii介导的疾病的药剂中的用途，其中诊断包括(a)获得受试者的测试生物样本；和(b)检测测试生物样本中camkii-δ9的水平或活性；其中在受试者的测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性指示受试者罹患camkii介导的疾病或罹患camkii介导的疾病的概率增加。132.在又一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的camkii介导的疾病的药剂，其中诊断包括(a)获得受试者的测试生物样本；和(b)检测测试生物样本中camkii-δ9的水平或活性；其中在受试者的测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性指示受试者罹患camkii介导的疾病或罹患camkii介导的疾病的概率增加。133.如本文所用，术语“诊断(diagnosis/diagnosing)”是指鉴定病理状态、疾病或病况，如鉴定camkii介导的疾病，或指鉴定患有camkii介导的疾病且可能受益于特定治疗方案的受试者。在一些实施方式中，诊断含有鉴定camkii-δ9的异常水平或活性。在一些实施方式中，诊断是指鉴定受试者的心脏类疾病或代谢类疾病。134.如本文所用，术语“生物样本”是指从感兴趣的受试者获得或衍生的生物组合物，其含有待表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体，例如基于物理、生化、化学和/或生理特征。生物样本包括但不限于通过本领域技术人员已知的任何方法获得的受试者的细胞、组织、器官和/或生物体液。在一些实施方式中，生物样本是体液样本。在一些实施方式中，体液样本是全血、血浆、血清、粘液(包括鼻腔引流物和痰)、腹膜液、胸膜液、胸水、唾液、尿液、滑液、脑脊液(csf)、胸腔穿刺液、腹腔液、腹水或心包液。在一些实施方式中，生物样本是从受试者的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤或血管获得的组织或细胞。在一些实施方式中，生物样本从受试者的心脏获得。135.根据本发明，检测测试生物样本中感兴趣的肽(例如泛素结合酶、camkii-δ9等)的水平或活性可以通过用于确定样本中肽的水平或活性的任何合适的手段实现。在一些实施方式中，检测方法包括免疫分析装置和方法，其可以各种夹心、竞争或其他分析形式利用标记分子。所述分析法将产生指示感兴趣的肽存在或不存在的信号。此外，信号强度可以与样本中存在的感兴趣的肽的量直接或间接相关(例如，成反比)。其他合适的方法包括测量感兴趣的肽特有的物理或化学性质，如其精确的分子质量或nmr谱。合适的检测方法还可以包括生物传感器、与免疫分析法耦合的光学装置、生物芯片、分析装置，如质谱仪、nmr分析仪或色谱装置。此外，合适的检测方法可包括基于微量板elisa的方法、全自动或机器人免疫分析法(例如可在elecsys分析仪上使用)、cba(酶促钴结合分析法，例如可在roche-hitachi分析仪上使用)和乳胶凝集分析法(例如可在roche-hitachi分析仪上使用)。在一些实施方式中，感兴趣的肽的水平或活性是通过测量可从样本中的肽获得的特定强度信号来检测。如上所述，此类信号可以是在感兴趣的肽特有的质谱或nmr谱中观察到的感兴趣的肽特有的m/z(质荷比)变量处观察到的信号强度。136.在一些实施方式中，测试生物样本中camkii-δ9的水平或活性是通过使样本与特异性结合camkii-δ9的试剂接触来检测。试剂将产生强度信号。根据本发明的结合包括共价和非共价结合。与根据本发明的camkii-δ9结合的试剂可以是与本文所述的camkii-δ9结合的任何化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。在一些实施方式中，试剂包括抗体、核酸、肽或多肽，如肽或其含有肽结合域的片段的受体或结合配偶体，以及适体，例如核酸或肽适体。制备此类试剂的方法是本领域中众所周知的。例如，商业供应商也提供合适的抗体或适体的鉴定和生产。本领域的技术人员熟悉开发具有更高亲和力或特异性的此类试剂的衍生物的方法。例如，可以将随机突变引入核酸、肽或多肽中。然后可以根据本领域已知的筛选程序，例如噬菌体展示，对这些衍生物进行结合测试。137.在一些实施方式中，非特异性结合可能是可容许的，如果它仍然可以被明确地区分和测量，例如根据其在蛋白质印迹上的大小，或通过其在样本中相对较高的丰度。试剂的结合可以通过本领域中已知的任何方法测量。在一些实施方式中，所述方法是半定量或定量的。合适的方法包括：(1)试剂的结合可以直接测量，例如通过nmr或表面等离子体共振；(2)如果试剂还充当感兴趣的肽的酶促活性的底物，则可以测量酶促反应产物(例如，可以通过测量裂解底物的量来测量蛋白酶的量，例如在蛋白质印迹上)。或者，试剂本身可以表现出酶促特性，并且与肽结合的试剂可以与合适的底物接触，从而允许通过产生强度信号进行检测。对于酶促反应产物的测量，在一些实施方式中，底物的量是饱和的。底物也可以在反应前用可检测标记进行标记。在一些实施方式中，样本与底物接触足够的时间段。足够的时间段是指产生可检测或可测量的产物量所需的时间。代替测量产物的量，可以测量出现给定(例如可检测)量的产物所需的时间；(3)试剂可以共价或非共价地与标记偶联，以便检测和测量试剂。标记可以通过直接或间接方法进行。直接标记涉及将标记直接(共价或非共价)与试剂偶联。间接标记涉及二级试剂与一级试剂的结合(共价或非共价)。二级试剂应与一级试剂特异性结合。所述二级试剂可以与合适的标记偶联和/或是三级试剂与二级试剂结合的目标(受体)。使用二级、三级或甚至更高级别的试剂通常是为了增加信号强度。合适的二级和更高级别的试剂可以包括抗体、二级抗体和众所周知的链霉亲和素-生物素系统(vector laboratories,inc.)。试剂或底物也可以用本领域已知的一个或多个标签进行“加标签”。此类标签就可以成为更高级别的试剂的目标。合适的标签包括生物素、地高辛、his-tag、谷胱甘肽-s-转移酶、flag、gfp、myc标签、甲型流感病毒血凝素(ha)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，标签位于n端和/或c端。138.在一些实施方式中，与camkii-δ9特异性结合的试剂是抗体或抗体片段。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。139.在一些实施方式中，将在测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性与在参考样本中检测到的camkii-δ9的参考水平或活性进行比较。140.如本文所用，术语“比较”是指将待分析的测试生物样本所包含的目标蛋白(例如泛素结合酶、camkii-δ9等)的水平或活性与合适的参考样本的水平或活性进行比较。应理解，如本文所用的术语是指相应参数或值的比较，例如绝对量与绝对参考量进行比较，而浓度与参考浓度进行比较，或从测试样本中获得的强度信号与参考样本的相同类型的强度信号进行比较。可以手动或计算机辅助进行比较。对于计算机辅助比较，所确定的量的值可以与对应于通过计算机程序存储在数据库中的合适参考值的值进行比较。计算机程序可以进一步评估比较的结果，并以合适的输出格式自动提供所需的评估。基于检测到的camkii-δ9的水平或活性与合适的参考水平的比较，有可能诊断出所述受试者的camkii介导的疾病。141.在一些实施方式中，在测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性高于camkii-δ9的参考水平或活性指示受试者罹患camkii介导的疾病或罹患camkii介导的疾病的概率增加。优选地，在测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性是camkii-δ9的参考水平或活性的至少2倍。更优选地，在测试生物样本中检测到的camkii-δ9的水平或活性是camkii-δ9的参考水平或活性的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍。142.如本文所用，术语“概率增加”是指与获得参考样本的受试者相比，受试者将罹患camkii介导的疾病的可能性水平总体增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、1倍、2倍、3倍、5倍、8倍、10倍、20倍、50倍或更大。143.在一些实施方式中，参考样本来自健康受试者，或者是比测试生物样本更早或更晚从同一受试者获得的样本。144.在又一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的camkii介导的疾病的试剂盒，其包含特异性识别camkii-δ9的抗体或抗体片段。在一些实施方式中，抗体或抗体片段与由camkii-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列特异性结合。试剂盒可以使用任何适合检测样本中camkii-δ9的含量或活性的手段。145.在一些实施方式中，试剂盒可以额外包含用户手册，用于解释关于诊断本技术中定义的受试者的camkii介导的疾病的任何测量的结果。特别是，此类手册可以包括关于什么确定的水平对应于什么种类的诊断的信息。此外，此类用户手册可以提供关于正确使用试剂盒组件检测camkii-δ9水平的说明。在一些实施方式中，用于检测的构件和试剂盒的说明手册在单个容器内提供。146.在一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制camkii-δ9活性的分子的方法，其包括使分子与包含(i)camkii-δ9和(ii)ube2t的样本接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了抑制camkii-δ9的分子。147.在另一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制camkii-δ9磷酸化能力的分子的方法，其包括使分子与包含(i)camkii-δ9和(ii)ube2t的样本接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了抑制camkii-δ9磷酸化能力的分子。148.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定治疗或预防camkii介导的疾病的分子的方法，其包括使分子与包含(i)camkii-δ9和(ii)ube2t的样本接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了治疗或预防camkii介导的疾病的分子。149.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减轻心脏损伤的分子的方法，其包括使分子与包含(i)camkii-δ9和(ii)ube2t的样本接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了减轻心脏损伤的分子。150.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定防止心肌细胞死亡的分子的方法，其包括使分子与包含(i)camkii-δ9和(ii)ube2t的样本接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了防止心肌细胞死亡的分子。151.在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减少dna损伤的分子的方法，其包括使分子与包含(i)camkii-δ9和(ii)ube2t的样本接触，并确定ube2t磷酸化是否被抑制，其中抑制ube2t磷酸化鉴定了减少dna损伤的分子。152.这些方法在本文中也称为药物筛选分析法，并且通常包括筛选候选/测试分子与camkii-δ9相互作用(例如结合)、调节camkii-δ9对ube2t的磷酸化和/或调节ube2t的可磷酸化残基与camkii-δ9介导的细胞内信号传导目标的相互作用的能力的步骤。153.在一些实施方式中，所述方法进一步包括确定所述分子是否直接结合所述camkii-δ9的步骤。154.在一些实施方式中，ube2t磷酸化的抑制是通过相对于对照比较样本中磷酸化ube2t的量来确定。在一些实施方式中，对照是样本中磷酸化ube2t的量相对于在分子不存在下或样本与分子接触后较早的时间点的所述量。在一些实施方式中，ube2t磷酸化的抑制是通过将样本中ube2t的磷酸化量相对于ube2t的总量的比率与对照进行比较来确定。在一些实施方式中，对照是样本中磷酸化ube2t的量的比率相对于在分子不存在下或样本与分子接触后较早的时间点的所述比率。155.在一些实施方式中，样本选自由体外、离体和体内离体组成的组。在一些实施方式中，样本包含细胞(例如心脏细胞)。在一些实施方式中，细胞获自受试者。在一些实施方式中，样本选自由组织、全血、血清、血浆、口腔刮片、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。156.在一些实施方式中，用于药物筛选分析法的候选/测试分子是小分子化合物，或抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，候选/测试分子使磷酸化ube2t的量减少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。157.待鉴定的本发明的候选/测试分子至少部分可以使用本领域已知的组合库方法中的多种方法中的任何一种获得，包括：生物库；空间可寻址的平行固相或溶液相库；需要解卷积的合成库方法；“一珠一化合物”库方法；以及使用亲和