子宫内膜样腺癌相关融合基因检测及其临床应用

　　1.本发明属于生物医学领域，具体涉及子宫内膜样腺癌相关融合基因检测及其临床应用。背景技术：2.子宫内膜癌(endometrial cancer，ec)是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，又称子宫体癌，是世界范围内的女性生殖道恶性肿瘤之一。多数子宫内膜癌患者就诊时为早期，经过手术、放疗化疗以及内分泌综合治疗后，5年总生存率超过90％；而晚期子宫内膜癌治疗患者，常伴有转移，且治疗后产生耐药性，预后差，病死率相对较高。迄今为止，对改善ec总体生存率尚无较好的治疗策略。ec分为ⅰ型和ⅱ型。ⅰ型，又称雌激素依赖型，合并肥胖、高血糖、高血脂等代谢疾病，多伴有内膜不典型增生，典型组织学类型有子宫内膜样腺癌。ⅱ型，又称非雌激素依赖型，与高雌激素无关，无内分泌代谢紊乱，伴有萎缩性内膜，低分化、侵袭性强，典型组织学类型有浆液性癌、透明细胞癌。其中子宫内膜样腺癌是子宫内膜癌中最常见的病理类型(约占80％以上)。不同病理类型的子宫内膜癌，预后存在明显差别，临床上即使相同期别ec，预后也有明显差异，提示与ec的基因相关。3.子宫内膜癌的发生与发展，不仅与癌基因、抑癌基因相关，同时也与相关驱动基因及新基因发现密切相关。近年来，关于融合基因在肿瘤中的作用的研究备受关注。融合基因是指将编码区首尾相连的两个或多个基因,置于同一套启动子、增强子、终止子、核糖体结合序列等控制之下,构成的基因嵌合状态，是染色体重排变异的结果。研究显示融合基因可影响肿瘤的多种生物学功能：(1)肿瘤发生，如runx1/eto融合基因可影响细胞周期，促进白血病发生发展；(2)肿瘤侵袭转移，如融合基因pten-col17a1可以通过促进col17a1高表达，调控基质金属蛋白酶水解细胞基质，促进脑胶质瘤转移；(3)肿瘤耐药，如融合基因rars-mad1l1可能通过fubp1/c-轴促进鼻咽癌的发生、诱导癌症干细胞特性和化疗耐药性。肺腺癌伴有sptbn1-alk融合，其具有增加对克唑替尼化疗和放疗先天性耐药性。gtf2i-rara是急性早幼粒细胞白血病(apl)患者中新发现的rara融合基因，对atra具有抗药性，靶向其下游rnf8基因可成为gtf2i-rara融合基因治疗的替代选择等，但目前子宫内膜癌的相关融合基因报道很少。4.目前融合基因主要分为dna水平上的融合和rna水平上的融合，可通过产生嵌合蛋白等多种方式，参与肿瘤的发生发展。其中rna水平上的融合基因又称作嵌合rna，通过“通读/拼接”、“转拼合”或“基因融合”等形成。融合基因不仅在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，同时靶向肿瘤融合基因的治疗同样具有重要的临床意义。如肺癌中靶向eml4-alk融合基因的药物ceritinib、alectinib、brigatinib和lorlatinib，已获得美国食品药品管理局(fda)批准，用于临床可提高疗效,改善预后和患者生存。其中克唑替尼的临床研发是肺癌治疗里程碑。妇科恶性肿瘤中靶向ntrk融合基因的治疗药物entrectinib和larotrectinib也已列入2020版卵巢癌nccn治疗指南中，但针对子宫内膜癌新融合基因及靶向治疗，报道很少。5.2013年癌症基因组图谱(tcga)计划小组提出基于子宫内膜癌基因组中基因测序，将子宫内膜癌分为四个不同预后分子分型:pole/超突变(pole)、微卫星不稳定(msi)、低拷贝数(cnl)和高拷贝数(cnh)，指导晚期和复发性疾病的治疗，但是仍存在对亚型之间的分类不准确，相同亚型的子宫内膜癌患者会出现预后不同的情况。因此，基于患者基因和分子特征的基因分型检测及靶向基因治疗在ec治疗领域中具有重要意义，研究和开发子宫内膜癌中的新融合基因及其意义是一个重要的研究方向，具有重要的临床价值和应用前景。技术实现要素：6.本发明的目的是针对子宫内膜癌提供一种发病及预后评估的试剂盒，所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。7.为实现上述目的，本发明首先提供了子宫内膜癌融合基因，名称为linc02159-atp10b，所述融合基因linc02159-atp10b的编码序列(cds)的核苷酸序列为seq id no.1的第683-5068位。8.所述融合基因linc02159-atp10b的基因组核苷酸序列为seq id no.1。9.所述融合基因linc02159-atp10b包括融合基因linc02159-atp10b以及融合基因linc02159-atp10b的任何功能等同物的多核苷酸。10.融合基因linc02159-atp10b由linc02159基因的2号外显子和atp10b基因的2号外显子基因融合形成，是编码框外的融合，可能并未影响基因atp10b的蛋白结构，融合基因linc02159-atp10b示意图如图5中c所示。11.本发明还提供了检测所述融合基因linc02159-atp10b表达水平的物质在制备评估子宫内膜样腺癌患者病理分期的产品中的应用。12.本发明还提供了检测所述融合基因linc02159-atp10b表达水平的物质在制备评估子宫内膜样腺癌患者病理分级的应用。13.本发明还提供了检测所述融合基因linc02159-atp10b表达水平的物质在制备评估子宫内膜样腺癌患者预后风险的应用。14.所述融合基因linc02159-atp10b表达水平可为mrna表达水平。15.进一步地，检测所述融合基因linc02159-atp10b的表达水平可通过逆转录-聚合酶链反应、实时荧光定量pcr技术、转录组测序技术、northern blot、原位杂交技术、基因芯片技术、nanopore测序技术或pacbio检测所述融合基因linc02159-atp10b表达水平。16.上述应用中，所述检测所述融合基因linc02159-atp10b的表达水平的物质包括特异性扩增所述融合基因linc02159-atp10b的引物对。17.所述扩增融合基因linc02159-atp10b的引物对由正向引物和反向引物组成，所述正向引物和反向引物序列可分别为：18.正向引物(上游引物primer f)：5’?gttgctttcattgaaacaaatgtcacc-3’(seq id no.2)；19.反向引物(下游引物序列primer r)：5’?gcaacatttggctgcatgtgg-3’(seq id no.3)。20.上述应用中，所述产品可作为试剂盒或基因芯片，所述试剂盒或基因芯片可为用于子宫内膜癌预后评估的试剂盒或基因芯片。21.进一步地，所述试剂盒可为子宫内膜癌预后评估提供检测，包括所述检测所述融合基因linc02159-atp10b mrna表达水平的物质。22.检测所述融合基因linc02159-atp10b mrna表达水平的物质，在本发明的保护范围内。23.所述基因芯片包括固相载体和固定在所述固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测融合基因linc02159-atp10b的寡核苷酸探针。24.本发明还提供了所述融合基因linc02159-atp10b在制备子宫内膜癌预后评估的产品(如试剂盒)中的应用。25.本发明还提供了检测所述融合基因linc02159-atp10b mrna表达水平的物质在制备子宫内膜癌预后评估的产品(如试剂盒)中的应用。26.上述应用中，所述产品的检测样本主要为子宫内膜腺癌组织。27.进一步地，所述检测样本为子宫内膜癌其他类型组织。28.本发明提供了检测所述融合基因linc02159-atp10b表达水平的物质，在评估子宫内膜样腺癌患者病理分期、病理分级及预后风险的产品中的应用。29.本发明所述基因linc02159(loc285629)通过试验证明：基因linc02159-atp10b通过过表达atp10b蛋白，影响子宫内膜癌的分期、分级等临床病理因素，进而影响子宫内膜癌患者的预后。30.本发明首次发现了子宫内膜样腺癌预后相关融合基因linc02159-atp10b，经过检测研究发现显示，融合基因linc02159-atp10b在子宫内膜癌组织中确定存在，且是发生在rna水平上的编码框外的基因融合；linc02159-atp10b融合基因在子宫内膜癌组织中具有一定的表达率，约为20.00％，在正常子宫组织中有一定表达，表达量约为10％。经统计分析显示其表达与子宫内膜癌的期别、分级以及体质指数(bmi)之间具有相关性(p《0.05)。31.进一步在对子宫内膜癌细胞系的鉴定中发现，linc02159-atp10b融合基因在子宫内膜癌细胞系rl95-2中表达阳性；验证发现融合基因linc02159-atp10b表达阳性的子宫内膜癌组织中基因atp10b表达也升高。生物数据分析显示基因atp10b表达与子宫内膜癌的期别、病理组织类型、bmi以及预后之间具有相关性(p《0.05)。32.综上，融合基因linc02159-atp10b可能通过促进atp10b蛋白质表达，促进子宫内膜癌发生发展，影响子宫内膜癌患者的预后。33.研究报道基因linc02159-atp10b可能通过过表达atp10b蛋白，影响子宫内膜癌的发生转移及分级等进而影响子宫内膜癌患者的预后。可能系基因linc02159(loc285629)与肿瘤发生、转移等相关。atp10b是p4-atpases家族蛋白之一，p4型腺苷三磷酸酶(atpases)家族与肿瘤的生物学功能密切相关，如atp8a1与肿瘤的侵袭转移相关,atp7b和atp11b与化疗耐药相关，atp11c与细胞凋亡相关。有研究对51例早期发病的非家族性大肠癌患者组织的外显子组测序，atp10b具有mmaf《5％的变异，可能是常染色体隐性遗传的潜在危险因素；还有研究发现atp10b基因可能与西妥昔单抗的耐药性以及大肠癌患者肿瘤免疫细胞浸润的增加有关。通过检测受试者子宫内膜癌组织中融合基因linc02159-atp10b mrna表达水平，可以应用于子宫内膜样腺癌的预后判定。因此，精确地预测子宫内膜样腺癌的预后，指导合理应用化疗药物，提高有效治愈率，对子宫内膜癌患者的临床治疗有重要的意义。附图说明34.图1为融合基因linc02159-atp10b的鉴定分析。图1中a：子宫内膜癌组织的rna水平上进行融合基因鉴定；图1中b：子宫内膜癌组织的基因组dna水平上进行融合基因鉴定；图1中c：rt-pcr条带的sanger测序图，包含融合基因linc02159-atp10b的融合位点；图1中d：rna-seq测序结果中包含融合基因linc02159-atp10b融合位点的基因序列信息。图中m为marker：linc02159-atp10b中m：dl100bp，gapdh中m：dl15000bp；re1：linc02159-atp10b融合基因测序阳性的子宫内膜癌组织。35.图2为子宫内膜癌组织re1全基因组测序结果(n＝149)。36.图3为融合基因在子宫内膜癌组织/细胞系/正常内膜组织中的鉴定。图3中的a和b为66例子宫内膜癌中融合基因linc02159-atp10b表达电泳图。箭头代表目的条带位置，包括融合基因目的条带和内参目的条带。图3中的c为子宫内膜癌细胞系rl95-2中融合基因linc02159-atp10b表达电泳图。图3中的d为15例正常子宫内膜中融合基因linc02159-atp10b表达电泳图。箭头代表目的条带位置，包括融合基因目的条带和内参目的条带。37.图4为融合基因linc02159-atp10b与ec的临床相关性。38.图5为融合基因linc02159-atp10b序列结构以及在该融合基因阳性样本中linc02159和atp10b基因mrna表达分析。图5中a：linc02159-atp10b融合位点前的序列来自于5号染色体的linc02159基因；图5中b：linc02159-atp10b融合位点后的序列来自于5号染色体的atp10b基因；图5中c：基因linc02159的2号外显子与基因atp10b的2号外显子融合成基因linc02159-atp10b示意图；图5中d：rna-sequencing检测组织/细胞atp10b和linc02159基因的mrna表达量，箭头表示linc02159-atp10b融合基因阳性样本。39.图6为基因atp10b在子宫内膜癌中的表达分析。图6中a：基因atp10b在正常子宫内膜组织与子宫内膜癌组织间的表达差异；图6中b：基因atp10b在相同ec患者中正常子宫内膜组织与子宫内膜癌组织间的表达差异；图6中c：基因atp10b表达与ec患者年龄相关性；图6中d：基因atp10b表达与ec肿瘤分期之间的相关性；图6中e：基因atp10b表达与ec肿瘤分级之间的相关性；图6中f：基因atp10b表达与ec患者bmi的相关性；图6中g：基因atp10b表达与ec病理组织类型的相关性(eea：endometrioid endometrial adenocarcinoma，sea：serous endometrial adenocarcinoma，mix:mixed serous and endometrioid；图6中h：基因atp10b表达ec患者淋巴结转移之间的相关性；图6中i：基因atp10b表达与ec患者预后之间的相关性。40.图7为融合基因相关预后分析图。具体实施方式41.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。42.发明概述43.子宫内膜癌发病不仅与癌基因、抑癌基因等相关，同时也与相关驱动基因及新基因发现密切相关。本发明描述子宫内膜癌相关融合基因。44.基因linc02159与肿瘤发生、发展相关。atp10b是p4-atpases家族蛋白之一，p4型腺苷三磷酸酶(atpases)家族与肿瘤的生物学功能密切相关，如atp8a1与肿瘤的侵袭转移相关,atp7b和atp11b与化疗耐药相关，atp11c与细胞凋亡相关。但有研究对51例早期发病的非家族性大肠癌患者组织的外显子组测序，atp10b具有mmaf《5％的变异，可能是常染色体隐性遗传的潜在危险因素；还有研究发现atp10b基因可能与西妥昔单抗的耐药性以及大肠癌患者肿瘤免疫细胞浸润的增加有关。通过试验证明：基因linc02159-atp10b可通过过表达atp10b蛋白，影响子宫内膜癌的分期分级等临床病理因素，进而影响子宫内膜癌患者的预后。45.在实际应用中，按照如下方法对子宫内膜样腺癌患者进行预后评估：检测待测患者的融合基因linc02159-atp10b的mrna表达水平，病理组织中融合基因linc02159-atp10b的mrna表达存在的待测患者的治疗预后低于病理组织中融合基因linc02159-atp10b的mrna表达阴性的待测患者，所述患者为子宫内膜样腺癌。所述治疗预后可体现为肿瘤化疗后治疗效果好，如肿瘤化疗治愈后再次复发时间长。也就是病理组织中融合基因linc02159-atp10b的mrna表达存在的待测患者的肿瘤化疗后治疗效果差于或候选差于病理组织不表达融合基因linc02159-atp10b的mrna待测患者。46.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。47.下述实施例中使用的实验材料如下：48.1.子宫内膜样腺癌组织样本49.66例子宫内膜癌组织取自2007年1月-2020年12月在北京大学人民医院及北京妇产科医院妇产科就诊、并经手术病理证实为子宫内膜癌病理标本(见表1)。其中25例(表1中序号4、17、22、26、30、33-35、37-44、48、51、53-55、57-59、62)为进行转录组测序(rna-seq)的样本信息，其余41例(表1中序号1-3、5-16、18-21、23-25、27-29、31、32、36、45-47、49、50、52、56、60、61、63-66)用于后续融合基因linc02159-atp10b临床表达检测的验证实验样本信息。50.手术标本切除后立即置于液氮中冻存，备用。临床分期(病理分期)依据是国际妇产科联盟分期(figo 2014)，病理分级依据figo 1989年病理分级标准。所有入组患者再次复核病理诊断结果及影像资料。51.详细记录患者的临床资料(年龄、体重指数(bmi)、淋巴结转移、病理组织类型以及临床分期、分级等)。参与本发明试验患者，试验均签署知情同意书，并通过医院伦理委员会批准。52.表1 66例子宫内膜癌患者临床病理资料53.54.[0055][0056]注：“linc02159-atp10b融合基因”列中的“阳性”表示该子宫内膜癌患者含有linc02159-atp10b融合基因的rna，“阴性”表示该子宫内膜癌患者不含有linc02159-atp10b融合基因的rna。[0057]2.子宫内膜癌细胞系[0058]用于融合基因在细胞系表达检测的人子宫内膜癌细胞系rl95-2(atcc细胞系)为北纳生物购买产品。[0059]3.pgem-t easy vector购自天根生化科技(北京)有限公司公司。[0060]实施例1子宫内膜样腺癌相关融合基因linc02159-atp10b的筛选[0061]入组患者的样本信息参见表2和表3：[0062]表2 25例子宫内膜样腺癌患者临床病理资料分析[0063][0064][0065]表3 15例正常子宫内膜组织病历资料分析[0066]编号年龄身高(cm)体重(kg)bmi临床诊断1311565020.54569子宫内膜息肉2411625721.71925子宫内膜息肉3371728528.73175子宫内膜息肉4461655118.73278子宫内膜息肉5291655319.4674子宫内膜息肉6291605421.09375子宫内膜息肉7361726220.95727子宫内膜息肉8431645921.93635子宫内膜息肉93416352.519.75987子宫内膜息肉10451627729.34004子宫内膜增生11581636223.33547子宫内膜息肉12461627227.43484子宫内膜息肉133816810537.20238子宫内膜息肉14381575321.50189子宫内膜息肉15461645520.44914子宫内膜增生[0067]2.转录组测序(rna-seq)主要方法与步骤[0068]提取组织rna，每样总rna含量为3mg，用于rna样品制备的输入材料。根据制造商的建议，使用nebnextultratmrna library prep kit for illumina(neb，美国)生成测序文库，并将索引代码添加到每个样品的属性序列中。[0069]信使rna(mrna)是用聚t寡聚糖基连接的磁珠从总rna中提纯出来的。在高温下，在neb第一链合成反应缓冲液(5x)。使用随机六聚体引物和mulv逆转录酶合成第一链互补脱氧核糖核酸。随后使用脱氧核糖核酸聚合酶ⅰ和核糖核酸酶h进行第二链cdna合成。剩余的突出端通过核酸外切酶/聚合酶活性转化为钝端。在脱氧核糖核酸片段的30个末端腺苷酸化后，neb下一个接头具有发夹环结构连接以准备杂交。[0070]用ampure xp系统(贝克曼库尔特，美国马萨诸塞州贝弗利)纯化文库片段。然后，使用3ml用户酶(neb)，在聚合酶链式反应(pcr)之前，在37℃下用大小选择的衔接子连接的cdna处理15分钟，然后在95℃下处理5分钟。然后用聚合酶、通用引物和指数引物进行聚合酶链反应。最后，纯化pcr产物(ampure xp系统)，并在安捷伦生物分析仪2100系统上评估文库质量。[0071]3.结果分析[0072](1)28例子宫内膜癌组织样本(25例患者)通过转录组测序，共发现544个融合基因，其中表达在2个及以上患者的融合基因如下(见表4)：[0073]表4 25例子宫内膜癌组织样本中融合基因表达情况[0074][0075](2)对5例正常子宫内膜组织进行转录组测序，检测融合基因如下：[0076]表5 5例正常子宫内膜组织融合基因表达情况[0077][0078]表6 5例正常子宫内膜组织病历资料分析[0079][0080]综上,我们首先研究显示：融合基因linc02159-atp10b在正常子宫内膜组织中的表达率为10.0％(2/20)，见图3。[0081]实施例2子宫内膜癌融合基因linc02159-atp10b表达及表达形式鉴定[0082]选择表1中序号为4的融合基因linc02159-atp10b阳性的子宫内膜癌组织进行下述实验。[0083]1.肿瘤细胞/组织总rna提取[0084](1)样品处理[0085]i组织：取液氮环境下冻存组织，每30mg组织经研磨器研磨后，加入1ml trnzol universal试剂处理。样品体积一般不超过trnzol universal试剂体积的10％。[0086]ii单层贴壁细胞：[0087]1)直接裂解法：直接在培养板中加入trnzol universal试剂裂解细胞，每10cm2面积加入1ml trnzol universal试剂。用取样器吹打几次。trnzol universal试剂加量根据培养板面积决定。如果trnzol universal试剂加量不足，可能导致提取的rna中有dna污染。[0088]2)胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸去培养基，用pbs洗涤细胞2遍，弃去pbs，向细胞中加入含有0.25％胰蛋白酶处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至rnase-free的离心管中，1000r/min离心3min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。[0089](2)将经过步骤(1)样品处理后获得的匀浆样品在室温放置10min，使得核酸蛋白复合物完全分离。每使用1ml trnzol universal试剂加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。[0090](3)4℃12,000rpm离心15min。样品会分成三层：粉色的有机相，中间层和上层无色的水相，把水相(约300μl)转移到新的离心管中。[0091](4)在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。[0092](5)4℃12,000rpm离心15min，去上清。离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。[0093](6)加入1ml 75％乙醇(用rnase-free ddh2o配制)洗涤沉淀。每使用1ml trnzol universal试剂至少用1ml 75％乙醇对沉淀进行洗涤。[0094](7)4℃8,000rpm离心5min。倒出液体，注意不倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不吸到沉淀。[0095](8)重复(6)和(7)步骤。室温放置晾干(3min左右)，根据实验需要，加入30-100μl rnase-free ddh2o，反复吹打，充分溶解rna。[0096](9)微量紫外分光光度仪对提取的总rna进行浓度和纯度检测。[0097]2.逆转录，合成cdna第一链[0098]使用fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂合成第一链cdna，1μg的总rna建立20μl反应体系。[0099](1)将模板rna在冰上解冻；5×fastking-rt supermix和rnase-free ddh2o在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心后收集残留在管壁的液体。在冰上进行反应体系配制。[0100](2)按照表7所示配制反转录反应体系[0101]表7反转录反应体系[0102][0103](3)按照表8所示进行反转录反应[0104]表8反转录反应条件[0105][0106](4)反应结束，反转录产物cdna用于后续pcr扩增的模板(template)或-20℃保存。[0107]3.pcr扩增linc02159-atp10b融合基因[0108](1)引物设计[0109]根据实施例1rna-seq结果中含融合位点的片段两端设计引物，[0110]上游引物序列(primer f)：5’?gttgctttcattgaaacaaatgtcacc-3’(seq id no.2，对应于图5中c的基因linc02159的外显子2内，对应于seq id no.1的第323-349位，)[0111]下游引物序列(primer r)：5’?gcaacatttggctgcatgtgg-3’(seq id no.3，对应于图5中c的基因atp10b的外显子2，对应于seq id no.1的第202-222位，)[0112]预计扩增产物长度为148bp。[0113]内参gapdh基因全长引物为，[0114]上游引物序列(primer f)：5’?atggtttacatgttccaatatgattcc-3’[0115]下游引物序列(primer r)：5’?ttactccttggaggccatgtgg-3’[0116]预计扩增产物长度为882bp。[0117](2)冰上配置反应体系，反应体系为20μl，如表9所示：[0118]表9 pcr反应体系[0119][0120](3)pcr反应循环的设置如表10所示：[0121]表10 pcr反应程序[0122][0123](4)结果检测：反应结束后取10μl pcr反应产物(目的pcr片段)，进行琼脂糖凝胶电泳检测。[0124]所述pcr反应产物为融合基因linc02159-atp10b的特异片段，其核苷酸序列为seq id no.1的第202-349位。[0125]4.琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物[0126](1)制备1.5％琼脂糖凝胶:称取0.75g琼脂糖，加入50ml的1×tae。使用微波炉加热3min，待琼脂糖温度下降至约60℃时，加入核酸染料gel red 5μl，轻轻混匀后倒入制胶板中。小心除去气泡，放置于室温待其完全凝固；[0127](2)凝胶凝固后拔出梳子。将凝胶放入核酸电泳槽中，倒入新配制的1×tae；[0128](3)先将混合了dna loading buffer的pcr产物，小心加入加样孔中；[0129](4)接通电源，100v,45min；[0130](5)切断电源，在全自动凝胶成像仪下成像并拍照。[0131]5.连接pgem-t easy vector及转化dh5α感受态细胞[0132](1)将载体(pgem-t easy vector)在冰上融化，为避免反复冻融载体，在初次使用时分装成小份，每次使用时取出一份，短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。[0133](2)按照表11的连接体系在无菌的离心管中加入各种成分，载体与目的pcr片段的摩尔比控制在1:8(1:3-1:8)，根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度及载体与目的pcr片段分子大小来计算其摩尔比。加入过多的片段反而会干扰连接反应:[0134]表11连接体系[0135][0136](3)轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。混合反应液置于16℃过夜。反应结束后，将离心管置于冰上，得到连接产物，命名为重组载体pgem-t-linc02159-atp10b。[0137](4)转化[0138]a、转化平板的制备[0139]向铺好的含有氨苄西林(amp)抗生素100μg/ml的固体琼脂平板表面加入16μl的iptg(50mg/ml)(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，溶剂为超蒸水)、40μl的x-gal(20mg/ml)(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-吡喃半乳糖苷，溶剂为二甲基甲酰胺)，使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃放置2h，使溶解x-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。[0140]b、转化[0141]1)取部分连接产物(重组载体pgem-t-linc02159-atp10b)加到100μl dh5α感受态细胞中(感受态细胞应刚从-70℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的1/10)，轻弹混匀，冰浴30min。[0142]2)将离心管置于42℃水浴90sec，取出离心管后立即置于冰浴中放置3min，其间不要摇动离心管。[0143]3)向离心管中加入250-500μl 37℃预热的lb(不含抗生素)培养基，150rpm、37℃振荡培养45min。使质粒(重组载体pgem-t-linc02159-atp10b)上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。[0144]4)将离心管中的菌液混匀，吸取100μl加到含氨苄西林(amp)抗生素100μg/ml的lb固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养16h。[0145]6.肿瘤基因组dna提取[0146](1)肿瘤组织或细胞的裂解：[0147]a、贴壁细胞的裂解：[0148]1)弃去培养液，每10cm2的贴壁细胞中加入3ml pbs，用移液枪的枪头吹落贴壁培养细胞，转移至离心管中，1,000rpm离心3min，弃上清，加入200μl pbs溶液悬浮细胞，转移至2ml ep管。[0149]2)加入180μl buffer gb、20μl的proteinase k和10μl的rnase a(10mg/ml)，收集细胞悬液，充分吹打混匀，于56℃水浴温浴10min。[0150]3)向裂解液中加入200μl 100％乙醇，充分吹打混匀。[0151]b、组织的裂解：[0152]1)取20mg的癌组织，液氮研磨后置于2ml ep管中。[0153]2)加入180μl的buffer gl、20μl的proteinase k和10μl的rnase a(10mg/ml)，于56℃水浴至组织完全裂解。[0154]3)向裂解液中加入200μl buffer gb和200μl 100％乙醇，充分吹打混匀。[0155](2)将spin column安置于collection tube上，溶液(裂解液)移至spin column中，12,000rpm离心2min弃滤液。[0156](3)将500μl的buffer wa加入至spin column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。[0157](4)将700μl buffer wb加入至spin column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。加液前确认buffer wb中已经加入指定体积的100％乙醇。[0158](5)重复操作步骤(4)。[0159](6)将spin column安置于collection tube上，12,000rpm离心2min[0160](7)将spin column安置于新的1.5ml离心管上，在spin column膜的中央处加入50～200μl的elution buffer，室温静置5min。[0161](8)12,000rpm离心2min洗脱dna。可将离心液体重新加入到spin column膜的中央，再次室温静置5min，12,000rpm离心2min洗脱dna。[0162](9)基因组dna定量。提取得到的基因组dna通过电泳或吸光度测定以定量。[0163]7.sanger测序/全基因组测序[0164](1)实验过程中纯化回收pcr产物以及转化菌落，由北京擎科生物科技有限公司(http://www.tsingke.net/shop/workflow/wl/shop_center/home/index.jsp)对其进行sanger测序。[0165](2)rna-seq结果中融合基因linc02159-atp10b阳性的子宫内膜癌组织样本，在液氮环境下，由北京诺禾致源生物科技有限公司(https://shuidi.cn/company)进行全基因组测序。[0166]验证ec组织和细胞系的rna-seq结果，对ec融合基因linc02159-atp10b进行鉴定：鉴定结果如图1和图2所示，采用rna-seq测序结果中融合基因linc02159-atp10b表达阳性的组织样本(re1)及hec-1a细胞系(1a)通过rt-pcr等实验进行鉴定，在rna-seq片段(reads)两端设计引物，预期产物大小150bp。[0167]1.5％琼脂糖凝胶电泳结果示：(1)ec组织/细胞的rna提取物进行融合基因linc02159-atp10b的pcr扩增,产物在约150bp位置有明显条带(图1中a)，条带纯化回收后,进行转化/sanger测序鉴定,结果与rna-seq结果高度一致，符合预期结果(图1中c和图1中d)。(2)ec组织/细胞的基因组dna提取物进行融合基因linc02159-atp10b的pcr扩增，在约150bp位置未见条带(图1中b)；rna-seq结果中该融合基因阳性的冰冻组织re1，进行全基因组测序，结果检测到149个融合基因，但是未检测到融合基因linc02159-atp10b(图2)，此与基因组水平上的pcr结果一致。提示该融合基因linc02159-atp10b的融合发生在rna水平，不存在该融合基因的染色体畸变。[0168]实施例3融合基因linc02159-atp10b在子宫内膜癌患者及子宫内膜癌细胞系rl95-2中的表达以及探讨其在患者中的表达与子宫内膜癌临床病理因素之间相关性[0169]1.组织总rna提取、rt-pcr(引物参见表12)以及琼脂糖电泳(同实施例2)[0170]表12 rt-pcr引物[0171][0172]2.sanger测序[0173]实验过程中pcr产物，由北京擎科生物科技有限公司(http://www.tsingke.net/shop/workflow/wl/shop_center/home/index.jsp)对其进行dna测序。[0174]结果如图3和图4所示：[0175]采用rt-pcr/sanger测序等方法，对子宫内膜癌(ec)组织样本进行表达鉴定。pcr引物采取融合位点外显子外设计引物，预期产物大小361bp。其中，f-linc02159-atp10b(exon1)对应于seq id no.1的第1-26位，r-linc02159-atp10b(exon1)对应于seq id no.1的第340-359位。[0176]结果显示：表1中的66例子宫内膜癌组织样本中，linc02159-atp10b融合基因检测阳性13例(20.00％，13/66)。其中子宫内膜癌和癌旁组织相对照的患者组织共18例，4例(22.22％，4/18)ec组织linc02159-atp10b融合基因阳性，其对应癌旁组织该融合基因表达呈现阴性，其余14例病例表达阴性(图3中a、b、c)；同时鉴定了15例正常子宫内膜组织，结合转录组测序的5例正常子宫内膜组织，共有2例病例该融合基因表达阳性(10.0％，2/20图3d)。进一步分析linc02159-atp10b融合基因与ec临床病理参数的关系。结果显示linc02159-atp10b融合基因与子宫内膜癌的期别、分级以及bmi之间具有相关性(p《0.05)，与肌层浸润及淋巴结转移之间无明显相关性(p》0.05，图4)。[0177]肥胖是ec最重要的危险因素之一，随着肥胖率的上升，ec的发病率也上升。在美国，所有ec的57％归因于肥胖。与其他癌症相比，ec与肥胖的关系最密切。体重指数(bmi)正常的女性终生罹患ec的风险为3％，但是每增加5个单位，ec的风险就会增加50％以上。越来越多的年轻肥胖女性被诊断出ec。尽管诊断时的平均年龄为63岁，但1990年至今的数据显示，年龄在50岁以下的女性病例持续增长。脂肪组织被认为是内分泌器官，会产生许多生物活性物质，如瘦素、脂肪因子vaspin和omentin-1等，参与子宫内膜癌发生、发展。linc02159-atp10b融合基因表达与在ec患者的bmi之间的统计学有意义(p《0.05，图4bmi)。提示可能该融合基因参与人体肥胖的某些分子机制，进而影响ec的发生、发展。[0178]肿瘤分期和分级对子宫恶性肿瘤的治疗和预后至关重要，其中早期ec患者(figo i-ii期)，其治疗后5年总生存率超过90％，但晚期/复发性子宫内膜癌，经过卡铂和紫杉醇联合化疗后，总生存期为37个月,5年生存率低。本研究显示linc02159-atp10b融合基因表达在早期与晚期子宫内膜癌有差异性(p《0.05，图4分级)，提示其可能参与子宫内膜癌发生与发展。[0179]子宫内膜样癌是在国际妇产科联合会(figo)系统中根据腺体和实体瘤成分的相对比例分为1至3等级进行分级，其中1级肿瘤的实体瘤成分较少超过6％；2级，介于6％和50％之间；3级，超过50％。1级和2级肿瘤被认为是低级肿瘤，通常与良好的预后相关，而3级肿瘤与中度至不良预后相关。本研究显示linc02159-atp10b融合基因表达在不同级别间差异性(p《0.05，图4分期)，提示该融合基因与子宫内膜癌肿瘤生物学有关。[0180]实施例4融合基因linc02159-atp10b序列结构以及表达分析[0181]1.采用二代测序(ngs)的方法对18例内膜癌组织[包括原发灶(图5的编号中以“pe”开头)、转移灶(图5的编号中以“re”开头)和复发时原发灶(图5的编号中以“rpe”)开头]、5例正常内膜组织(图5的编号为n1-n5)中linc021591和atp10b mrna的表达情况进行测定。[0182]ngs扩增子测序法引物由thermofisher公司设计、合成；采用ionampliseqtm文库试剂盒2.0制备文库，pcr初始模板量为12-16ng；采用ion library taqman quantitation kit文库定量试剂盒对文库进行qpcr检测；采用ion 540tm ot2试剂盒进行乳液pcr和isp富集，最后使用540芯片进行上机测序。ngs测序结果由ion torrent ss仪器自带软件和插件进行初步分析，得到该540芯片上样率，人类基因组参考序列匹配度，整体数据量和中位测序长度等，还可获得每个标本的在靶率，平均深度，均一度，bam及vcf文件等数据。最后对vcf文件进行注释，并用igv软件查看bam文件进行确认，以排除假阳性。(在靶率97-99％,平均深度2000x，均一度94-97％，中位测序长度195bp)。[0183]所有数据均为fpkm校正后的数据。其中fpkm(fragments per kilo bases per million fragments)，是每百万测序片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目。[0184]结果如图5所示：linc02159(图5中a)和atp10b(图5中b)均位于人类第5号染色体长臂34(5q34)上，融合基因linc02159-atp10b由linc02159基因的2号外显子和atp10b基因的2号外显子融合形成，是编码框外的融合，并未影响基因atp10b的蛋白结构，该融合基因融合示意图如下(图5中c)。[0185]融合基因linc02159-atp10b阳性样本与该融合基因阴性的样本相比，atp10b mrna的表达水平明显升高；linc02159 mrna的表达水平也增高(图5中d)。[0186]结果显示，融合基因linc02159-atp10b可能通过促进atp10b蛋白质表达，促进子宫内膜癌发生发展。[0187]实施例5基因atp10b与子宫内膜癌的临床相关性[0188]1.癌症基因组图谱(tcga)是由美国国家癌症研究所和美国国家人类基因组研究所牵头的大规模合作研究，用于绘制32种人类癌症中发生的基因组和表观基因组变化。在此肿瘤信息库里，有大量的基因信息以及相对应的临床信息可供研究者进行研究，解决了肿瘤个体化临床标本的困难。采用tcga数据库数据分析基因atp10b表达与子宫内膜癌(ucec)临床病理因素之间的相关性；同时分析基因atp10b表达与ec预后间的相关性。[0189]2、统计方法：采用软件spss version 23.0(spss inc,chicago,il,usa)、r(v.4.1.0)与perl进行统计分析：计量资料以(x±s)表示，计数资料以率(％)表示。采用x2检验、cox回归等分析其表达对患者独立预后的影响。生存分析采用kaplan-meier法。以p《0.05表示结果差异有显著性。[0190]结果如图6所示：(1)基因atp10b在ec患者癌组织与正常子宫内膜组织之间的表达存在差异(p《0.05图6中a)，但是在配对差异分析中，同一个患者其正常组织与ec肿瘤组织间的表达未见明显差异(p＝0.05图6中b)。(2)基因atp10b表达与子宫内膜癌的期别、bmi以及病理组织类型之间具有相关性(p《0.05，见图6中d、6中f、6中g)；基因atp10b表达与子宫内膜癌的年龄、分级以及淋巴结转移之间无相关性(p》0.05，见图6中c、图6中e、图6中h)。(3)数据库分析显示，高表达基因atp10b的样本共136例，低表达atp10b样本数407例，生存分析结果显示，atp10b基因表达与ec的预后呈负相关(p《0.05图6中i)。[0191]实施例6融合基因linc02159-atp10b的表达与ec预后的相关性[0192]截止2021年10月，共随访了56例患者，平均随访52.6个月(10-160个月)，其中融合基因阳性组10例，平均随访51.0个月(10-160个月)，目前均存活，其中融合基因阴性组46例，平均随访52.9个月(10-158个月)，两例死亡。两组总生存分析结果比较差异无显著性(p＝0.57)，(图7上方线条为融合基因阳性组生存曲线，下方线条为融合基因阴性组生存曲线)。这可能与入组病例期别较早，随访时间较短有关。共11例复发患者中，融合基因linc02159-atp10b阳性4例(4/10，40.0％)，融合基因linc02159-atp10b阴性7例(7/46，15.2％)。[0193]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。