一种利用miR-3131作为预测脑动静脉畸形的生物标记物的应用

　　一种利用mir-3131作为预测脑动静脉畸形的生物标记物的应用技术领域1.本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及利用mir-3131作为预测脑动静脉畸形的生物标记物的应用。背景技术：2.脑动静脉畸形(brain arteriovenous malformations，bavms)是一种少见的血管病变，主要病理特征为动脉与静脉之间没有正常毛细血管床，动脉与静脉直接相通，使得动脉血液没有经过毛细血管床而是直接流入引流静脉。脑动静脉畸形通常发生在年轻人身上，表现为癫痫发作、神经功能缺损、头痛或破坏性自发性颅内出血。3.目前，现有技术并不能对脑动静脉畸形进行预测，这使得医生较难对病情诊断、发展趋势、用药效果及病愈的时间等进行进行精准的衡量，从而影响脑动静脉畸形的治疗效果。技术实现要素：4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用mir-3131作为预测脑动静脉畸形的生物标记物的应用，mir-3131作为生物标记物能够对脑动静脉畸形进行精准预测。5.本发明实施例提供一种利用mir-3131作为预测脑动静脉畸形的生物标记物的应用，所述应用包括：所述mir-3131的基因序列如序列表中seq id no：1所示。6.具体地，所述应用包括：利用mir-3131作为预测kras突变的脑动静脉畸形的生物标记物。7.具体地，所述应用包括：利用mir-3131作为预测krasg12d突变的脑动静脉畸形的生物标记物。8.本发明实施例提供一种利用mir-3131作为预测脑动静脉畸形的生物标记物的应用，具体应用包括将外泌体mir-3131是krasg12d bavm患者的生物标志物，利用外泌体mir-3131能够准确预测待测样品是否为脑动静脉畸形。9.本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。附图说明10.附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。11.图1是本发明实施例提供的外泌体mir-3131相对表达水平的散点图。具体实施方式12.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。13.本发明实施例提供一种利用mir-3131作为预测脑动静脉畸形的生物标记物的应用，利用mir-3131作为预测kras突变的脑动静脉畸形的生物标记物，mir-3131的基因序列如序列表中seq id no：1所示，具体为5’?ucgaggacug guggaagggccuu-3’。14.具体地，应用包括：利用mir-3131作为预测krasg12d突变的脑动静脉畸形的生物标记物。15.具体地，应用包括：利用mir-3131作为预测krasg12d突变的脑动静脉畸形中内皮间充质转化的生物标记物。16.获得原代bavm(brain arteriovenous malformation，脑动静脉畸形)内皮细胞的具体步骤如下：17.1、获得bavm组织：本实施例采用的20例bavm组织的标本分别来自首都医科大学(中国北京)北京天坛医院神经外科的20例bavm患者(编号为患者1～患者20)。出于研究目的，获得了将bavm组织存入银行的知情同意。用于研究目的的bavm组织的收集经北京天坛医院伦理委员会批准。bavm组织被密封在装满盐水的无菌玻璃瓶中，并转移到实验室进行分离和培养。18.2、bavm组织的分离和培养：将bavm组织用杜氏磷酸缓冲盐溶液(dpbs，#d8537，sigma，usa)洗涤，将洗涤后的bavm组织切成小方块，并与浓度为0.1％的胶原酶i(#c2674，sigma，usa)混合后在37℃下孵育15分钟，进行预消化。将预消化的bavm组织通过100μm的细胞过滤器(#352360，bd biosciences，usa)进行过滤。将通过细胞过滤器的细胞悬液以300×g离心3分钟，得到沉淀，然后将沉淀重悬于内皮培养基(ecm，#1001，sciencell，usa)中。使用抗cd31磁珠(#130-091-935，miltenyibiotec，germany)分离bavms内皮。在t75烧瓶(#3290，corning，usa)中用ecm重新悬浮bavms内皮细胞，得到原代bavm内皮细胞，即原代bavm ecs。19.全外显子和ddpcr验证krasg12d突变20.原代bavm内皮细胞的dna提取和全外显子组测序均使用市售试剂盒(gentrapuregene，qiagen，德国)从bavm内皮细胞中分离基因组dna。使用两种方法检查dna的质量。1、在浓度为1％的琼脂糖凝胶上监测dna的降解和污染，并使用qubit 2.0荧光计(invitrogen，美国)测量基因组dna浓度。每个样本总共使用0.6μg基因组dna进行文库的制备。使用agilent sureselect human all exon v6试剂盒(agilent technologies，usa)生成测序文库并添加索引代码。使用hiseq pe cluster kit(illumina，usa)在cbot cluster generation system上对索引编码的样本进行聚类。聚类后簇生成，并在illumina hiseq平台上对dna文库进行测序，并生成150bp双末端读数。使用ddpcr验证了krasg12d内皮细胞突变。最终，20名bavm患者中有6名被发现在bavm内皮细胞中具有krasg12d突变，这6名患者分别为患者1、患者2、患者3、患者4、患者10和患者18。选取患者1、患者2、患者3、患者4和患者10的bavm内皮细胞中作为待测样本。21.制备对照样本，在本实施例中对照样本为kraswt慢病毒的bavm(kraswtbavm)和huvec(人脐静脉内皮细胞，human umbilical vein endothelial cells)，在5例kraswtbavm的内皮细胞和5例huvec的内皮细胞中分离出外泌体。在本实施例中，分离外泌体的方法包括：将5例待测样本、5例kraswtbavm和5例huvec的内皮细胞分别在外泌体耗尽的内皮培养基(endothelial cell medium，ecm)中分别培养48小时后进行传代。为了防止污染和干扰，每次传代用杜氏磷酸缓冲盐溶液洗涤，并在37℃，浓度为5％co2的恒温孵育箱中培养至少7天，得到培养上清液。提取培养上清液中的外泌体，提取外泌体的方法包括：将培养上清液在4℃下，以3000×g离心15分钟，然后以10000×g离心30分钟以去除细胞和碎片，得到上清液。用0.22-μm过滤器(millipore)进一步过滤该上清液。将过滤后的上清液在4℃下，以110000×g离心90分钟以沉淀外泌体，弃掉上清液，得到沉淀。将沉淀悬浮在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，pbs)中，得到含有外泌体的悬浮液。22.提取总外泌体mirna，具体方法包括：采用trizol方法提取含有外泌体的悬浮液中的总外泌体mirna，得到总外泌体mirna。23.利用rt-pcr对总外泌体mirna进行测序，具体地，使用不含苯酚的mirvana mirna isolation kit(cat#am1561，ambion，austin，tx，us)试剂盒提取和纯化总rna，并按照试剂盒的说明书进行操作。采用来自安捷伦科技公司的人类mirna微阵列(8*60k)，其中包含来自mirbase v21.0数据库的2549个人类mirna的探针。根据制造商的方案(agilent technologies，santa clara，ca)，从每个样品中提取的总rna(100ng)用作样品标记和杂交制备的输入。使用扫描仪控制将微阵列图像信息转换为斑点强度值软件版本7.0(安捷伦科技，加利福尼亚州圣克拉拉)。原始数据通过包含在r包agimicrorna(lópez-romero,p.bmc genomics.2011.)中的quantile算法进行标准化。24.然后，使用t检验鉴定血清中差异表达的mirna，截止标准为p《0.05和倍数变化》1.2。25.芯片测序结果使用rt-qpcr进行验证。rt-qpcr大致流程为：rna提取过程同前，使用mirna cdna建库试剂(kr211,tiangen,china)和荧光定量试剂(fp411,tiangen,china)进行rt-qpcr验证。引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为5’?tcgaggactggtggaagg-3’，如序列表中seq id no：1所示；下游引物序列为5’?cgcttcggcagcacatatactaaaattggaac-3’，如序列表中seq id no：3所示，使用的内参基因为u6。26.结果如图1所示，由图1可知，mir-3131在5例krasg12dbavm的内皮细胞中的表达水平均显著高于5例kraswtbavm的内皮细胞，且倍数变化＝498.36，****p《0.0001，同时，mir-3131在5例krasg12dbavm的内皮细胞中的表达水平均显著高于5例huvec的内皮细胞，且倍数变化＝33.41，*p＝0.0310。由此可见，外泌体mir-3131是krasg12d bavm患者的潜在生物标志物。27.虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。