PD-1 单克隆抗体对体外诱导扩增的 CIK细胞抗肺癌效应的影响

　　肺癌是我国目前最常见的恶性肿瘤，是男性最常发病的恶性肿瘤，发病率为 57.26/10 万，死亡率位居我国恶性肿瘤死亡率的首位[]。人们常规上将肺癌主要分为两种类型，一种为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），约占肺癌总数的 85%，主要包括三种组织学亚型：腺癌、鳞状细胞癌（鳞癌）和大细胞癌。其中约 16% 的 NSCLC 患者表现为早期疾病，如病变局限于胸部和原发肿瘤<5 cm，但大多数 NSCLC 患者是在晚期确诊的，此时常规治疗方法都没有明显效果[]。肺癌的另外一种主要类型为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），约占肺癌总数的 13%～15%，是支气管上皮发生的未分化、伴有神经内分泌分化的一种与预后不良相关的侵袭性恶性肿瘤[]。作为一种高侵袭性的神经内分泌肿瘤，SCLC 具有高生长分数、较短的倍增时间和广泛转移的早期发展等特点，导致 SCLC 患者的预后极差[]。

　　目前现有的肿瘤免疫疗法分为三大方向：免疫检查点抑制剂、细胞免疫治疗和肿瘤疫苗[]。其中过继细胞免疫治疗是一种针对多种癌症切实可行且有效的治疗方法[-]。活化的免疫细胞可以在静脉注射后几分钟内到达病变部位，并选择性地进入恶性肿瘤组织，在治疗后 24 h 内，大量的免疫活性细胞可以在病变部位积聚并杀伤肿瘤[]。CIK 细胞是通过体外诱导活化的淋巴细胞，作为一种具有自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）样的天然细胞毒性潜能的 T 淋巴细胞，CIK 细胞可通过供体外周血单个核细胞诱导分化而来，并且具有对正常细胞无毒性、抗瘤谱广（对多重耐药的癌细胞同样敏感）、增殖速度快、无 T 淋巴细胞杀伤时的组织相容性复合体（MHC）限制性等特点，因此被广泛应用于过继细胞免疫治疗。有研究[]表明，CIK 细胞免疫治疗和 PD-1 单克隆抗体联合治疗可延迟肿瘤的生长，也有研究[]表明 PD-1 单克隆抗体与 CIK 细胞免疫治疗联合应用可显著增强细胞毒性和抗肿瘤反应。目前肺癌的治疗趋向于多种治疗方法联合应用，尤以免疫治疗的进展最为显著。因此本文通过体外细胞水平实验将新兴的 PD-1 单克隆抗体与 CIK 细胞治疗联合起来分析其抗肺癌效应及影响因素，意在为以后的临床应用提供实验依据和理论支持。

　　CIK 细胞由大连市中心医院肿瘤内科 2019 年 1～5 月确诊的中晚期肺癌患者外周血培养而来。受试者需符合全部下列标准：（1）经过病理组织学或细胞学确诊的ⅡB～ⅢA 期（美国癌症联合委员会第 8 版）肺腺癌或肺鳞癌；（2）年龄 18～70 岁；（3）有患者本人或法定代理人签署知情同意书；（4）综合身体状况较好，Karnofsky 功能状态（KPS）评分≥60 分；预期生存时间≥12 个月；（5）均无已知的其它恶性肿瘤病史；（6）筛选时的血常规结果：白细胞计数≥0.3×1010/L，血小板计数≥10×1010/L，血红蛋白≥90 g/L。符合下列任一标准的受试者即被排除：（1）妊娠或哺乳期女性、准备在研究期间妊娠或哺乳的女性；（2）人类免疫缺陷病毒抗体检测阳性或梅毒阳性；（3）多器官功能衰竭或有器官移植史者；（4）4 周内使用过大量糖皮质激素或其它免疫抑制剂者；（5）严重脓毒血症、败血症，或患有不可控制的感染性疾病者；（6）依从性差，由于身体或个人原因无法进行采血，或无法配合治疗的患者；（7）既往 6 个月内曾接受过免疫检查点抑制剂治疗、过继细胞免疫治疗、靶向药物或其它类型免疫治疗；（8）筛选前 30 d 内曾接受其它任何试验药物治疗或参加过另一项干预性临床试验；（9）入组后出现严重过敏反应需使用激素处理的受试者；（10）既往有已知或可疑的活动性自身免疫性疾病；（11）其他研究者认为不适合入组的情况。共有 20 例肺癌（16 例腺癌、4 例鳞癌）患者符合上述受试者标准，其中男 8 例、女 12 例，平均年龄 42～65（56.45±5.89）岁。肺癌 A549 细胞取自大连市中心医院中心实验室细胞库，裸鼠（BALB/c-nu）取自大连医科大学动物实验中心（辽宁长生生物技术股份有限公司），余实验所需器械试剂均来源于大连市中心医院中心实验室。

　　从细胞库中取出装有肺癌 A549 细胞冻存管一枚，置入 38℃～40℃ 水浴中 60 s 复苏，期间快速晃动，直到冷冻管内部结冰完全融化。以 75% 酒精消毒冻存管管壁，在超净工作台打开冻存管，以一次性实验室用塑料吸管（5 mL）尽量完整吸取冻存管内细胞后移至离心管中，补加 10 mL PBS（Hyclone，美国），离心管置入离心机（Eppendorf，德国）中低速（1 500 r/min）离心 5 min，弃去离心管中废液，补加 DMEM 培养基（Hyclone，美国）和 10% 胎牛血清（Gibco，美国）的联合培养基 10 mL 后移入培养瓶，放置于 5% CO2、37℃ 培养箱中培养。当显微镜下观察培养瓶中贴壁细胞 80% 贴壁生长后，以 75% 酒精消毒培养瓶体，在超净工作台打开培养瓶，弃掉瓶中培养液，以塑料吸管吸取 0.25% 胰蛋白酶 3 mL 后轻轻拍打瓶底，显微镜下观察细胞贴壁情况，当细胞呈单个状态后加入 7 mL 培养基终止消化过程，将培养瓶中液体倒入离心管后离心机离心 5 min（转速2 000 r/min），弃上清液后加入 10 mL 培养基，分两瓶装后补加培养基，放入培养箱中培养，及时换液传代，取呈对数生长期的细胞用于实验。

　　取肺癌患者外周血，通过密度梯度离心法从全血中分离获得人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），体外添加干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ，1000 U/mL，Peprotech，美国），抗 CD3 单克隆抗体（50 ng/mL，eBioscience，美国）和白细胞介素 2（interleukin-2，IL-2，1 000 U/mL，Boehringer Mannheim，德国）等细胞因子诱导。每 5 d 加入新鲜完整培养基，持续 14～21 d。显微镜下观察 CIK 细胞生长情况。

　　培养箱中取出培养 2 周的 CIK 细胞，用 PBS 冲洗 2 次后，分别加入下列单克隆抗体：CD3-FITC、CD56-PC7、CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-FITC（均购于 Beckman，美国）、CD279-APC（抗 PD-1，购于 Biolegend，美国）。室温下避光孵育 30 min 后 PBS 离心洗涤后加入 PBS 重悬，流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）检测细胞表型。

　　于培养箱中取呈对数生长期的肺癌细胞 A549，消化后调整其密度呈 5×104/mL。实验设肺癌细胞 A549 作为靶细胞，设培养 2 周的 CIK 细胞作为效应细胞，所有组 CIK 细胞均取自同一患者。准备 96 孔板，实验设置 CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体组（每 1×106 个 CIK 细胞加入 6 μg PD-1 单克隆抗体孵育 2 h，PD-1 单克隆抗体购于 Abcam，英国）、单独 CIK 细胞不含 PD-1 单克隆抗体组和单独 PD-1 单克隆抗体组，另设单独肺癌 A549 细胞和 CIK 细胞组作为对照，每组变量设置 3 个复孔。分别按不同效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1）把效应细胞和肺癌 A549 细胞接种于 96 孔板。单独 CIK 细胞（不含 PD-1 单克隆抗体）组杀伤效应实验：以先前设定的效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1），将单独的 CIK 细胞（不含 PD-1 单克隆抗体）作用于靶细胞。CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体组杀伤效应实验：与上述实验方法相同，将 CIK 细胞与 PD-1 单克隆抗体联合培养后按照特定的效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1）作用于靶细胞，单独单克隆抗体组杀伤实验设计同上。3 组放入培养箱培养 24 h 后，?20℃ 取 CCK-8 试剂（同仁化学生物公司，日本）复温，每孔加入 10 μL 后，放入 37℃，5% CO2 培养箱孵育 4 h，酶标仪（Bio-rad 680，美国）450 nm 检测光密度（optical density，OD）。杀伤分数为：1?×100%。

　　实验设置 PD-1 单克隆抗体联合 CIK 细胞培养组与单独 CIK 细胞组，在相同环境下检测两组 CIK 细胞的穿孔素和颗粒酶表达水平。以 PD-1 单克隆抗体联合 CIK 细胞培养组为例，取体外诱导扩增 14 d 的 CIK 细胞与 PD-1 单克隆抗体共培养（方法同上文），诱导后的 CIK 细胞用 PBS 洗涤后调整细胞数量为 1×106 个，加入 20 μL 的 PerCP-Cy5.5-CD3 和 5 μL 的 FITC-CD56 抗体（eBioscience，美国），室温下避光孵育 15 min，再次 PBS 洗涤，加入 100 μL 破膜剂 A，室温避光孵育 15 min，PBS 洗涤后加入 100 μL 的破膜剂 B（Caltag，美国），在管中加入 5 μL PE-Granzyme B 和 20 μL PE-perforin 抗体（PeproTech，美国）共同孵育 15 min，PBS 洗涤后进行流式细胞仪检测分析。单独 CIK 细胞组的穿孔素和颗粒酶检测方法同上。

　　取肺癌 A549 株作为靶细胞，设定 CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体组和单独 CIK 细胞组，测定在效靶比 40∶1 时两组 CIK 细胞的细胞因子 IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌水平，各组 CIK 细胞均取自同一患者。取呈对数生长期的肺癌 A549 细胞，调整细胞密度为 1×105/mL。取 48 孔板种植 100 μL 的肺癌 A549 细胞。PD-1 单克隆抗体加 CIK 细胞组：将 CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体培养后（方法同前文）加入到靶细胞中。单独 CIK 细胞组：取相同数量的 CIK 细胞，单独作用于靶细胞中。另设对照组，不含 PD-1 单克隆抗体及 CIK 细胞。共培养 48 h 后收集上清液，ELISA 法（试剂购于 eBioscience，美国）测定细胞因子 IL-2、IFN-γ、TNF-α。

　　统计学分析采用 GraphPad Prism 5.0 软件和 SPSS（Statistical Product and Service Solutions）21.0 软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用 t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

　　本研究经大连市中心医院伦理委员会批准并监督，审批编号：2019-004-27，所有实验都按照世界医学协会的道德规范进行。所有入组患者均已签署知情同意书，本研究符合临床试验管理规范指导原则、药物临床试验质量管理规范和《赫尔辛基宣言》的伦理准则。

　　本研究选择 20 例确诊中晚期肺癌患者进行 CIK 细胞的制备，在体外诱导扩增 2 周后通过流式细胞仪检测其表型，结果显示其中 CD3+CD56+细胞所占比例为 31.58%±7.63%，CD3+细胞所占比例为 89.86%±3.23%，CD3+CD8+细胞所占比例为 52.24%±5.26%，CD3+CD4+细胞所占比例为 34.99%±5.56%。数据显示 20 例肺癌患者体外诱导产生的 CIK 细胞中所含 CD3+CD56+细胞亚群比例接近。

　　在 CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体组和单独 CIK 细胞组的肺癌细胞杀伤实验中，二者杀伤效应均呈现对效应细胞浓度的依赖性且趋势相同；见。在不同效靶比的条件下，CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体组与单独 CIK 细胞组对肺癌 A549 细胞的杀伤效应差异具有统计学意义：E∶T 为 5∶1（28.5%±1.9% vs. 20.3%±1.8%，P<0.05）、10∶1（40.6%±2.4% vs. 31.7%±2.1%，P<0.05）、20∶1（57.4%±3.5% vs. 44.7%±3.8%，P<0.05）、40∶1（74.1%±8.3% vs. 60.8%±5.3%，P<0.05）。在不同效靶比条件下，两组 CIK 细胞对肺癌 A549 细胞的杀伤效应均明显优于 PD-1 单克隆抗体组（P<0.01）。不同来源的 CIK 细胞杀伤实验结果相近。

　　与单独的 CIK 细胞组相比，CIK 细胞与 PD-1 单克隆抗体联合培养后，细胞穿孔素释放水平差异有统计学意义（P<0.05），细胞颗粒酶释放水平差异同样具有统计学意义（P<0.05），提示 PD-1 单克隆抗体对于 CIK 细胞穿孔素及颗粒酶的表达阳性率具有促进作用；见。

　　在 A549 肺癌细胞条件下，CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体对比 CIK 细胞单独应用结果提示 CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体组 IL-2 释放多于 CIK 细胞组，差异具有统计学意义（P<0.05）；见。CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体组 TNF-α 释放多于 CIK 细胞组，差异具有统计学意义（P<0.05）；见。CIK 细胞联合 PD-1 单克隆抗体组 IFN-γ 释放多于 CIK 细胞组，差异具有统计学意义（P<0.05）；见。以上结果证实了 PD-1 单克隆抗体对于 CIK 细胞因子分泌水平有着明显的促进作用。

　　癌症作为威胁人类健康的头号疾病，现已成为中国乃至全世界各地的主要公共卫生问题，预计在未来几十年里仍有较高的发病率和死亡率[]。肺癌是最常见的癌症之一，也是全球范围内癌症相关性死亡的最常见原因[]。肺癌标准的治疗方案包括手术、化疗和放疗。然而，由于肿瘤类型不同、部分患者体质不允许或多发肿瘤情况的存在，很大一部分肺癌患者往往不能通过传统方式治疗。在可以选择这些治疗手段的患者中，总的 5 年生存率为 16.6%，这可能是由于患者确诊时就已经存在转移性疾病或微小的残留病灶[]。

　　先天性免疫和适应性免疫是抑制肿瘤生长和帮助人体清除肿瘤细胞的重要因素[]。当二者出现功能障碍时，往往可能导致肿瘤的发生。恶性肿瘤患者无法有效治愈的原因之一可能就是由于机体免疫功能低下，无法启动有效的免疫应答[-]。过继细胞免疫治疗的研究进展为晚期肺癌患者的治疗提供了广阔的治疗前景，通过在体外扩增自体肿瘤特异性效应细胞，然后再回输到宿主体内，促进免疫应答的能力，提高人体的抗肿瘤细胞免疫反应[]。CIK 细胞首次于 1991 年被发现[]，它具有 T 细胞和 NK 细胞的共同特征及非 MHC 限制性的抗肿瘤能力。具有这种双重 T/NK 表型的细胞毒性细胞很少见，约占人体循环血液的 1%～5%。CIK 细胞除了直接杀伤肿瘤细胞外，还可通过分泌多种细胞因子调节免疫功能。大量研究[]表明，在肿瘤细胞的刺激下，CIK 细胞分泌 TNF-α、IFN-γ 和 IL-2 水平显著上调，这些细胞因子进一步增强了系统的抗肿瘤活性，诱导免疫应答。

　　根据免疫监视理论，在癌症早期宿主可以通过激活先天性和适应性免疫机制来控制肿瘤的生长，但当一些肿瘤细胞的表观遗传发生了变化后，我们的免疫系统就无法识别肿瘤细胞表面表达的异常蛋白，进一步使得肿瘤细胞逃避人体的免疫系统[]。在免疫系统识别肿瘤的过程中，T 细胞受体首先识别 MHC 所递呈的肿瘤特异性抗原作为激活 T 细胞的第一信号。然而单靠抗原刺激无法充分激活 T 细胞，免疫细胞还需要共刺激信号才能被充分激活。机体为了避免自身免疫反应，防止免疫系统被过度激活，一些检查点分子被放置在各个关键节点，用来检查和平衡免疫反应。例如 PD-1 就是这样一种免疫检查点分子，在活化的 T 细胞中表达。一旦 PD-1 与肿瘤细胞表面表达的 PD-L1 结合，T 细胞对肿瘤的识别能力就会受到抑制，从而导致免疫细胞死亡或失去免疫杀伤的能力。免疫检查点抑制剂可以阻断这种途径，重新恢复机体免疫功能，因此免疫治疗的原理并不是直接使用药物杀死肿瘤细胞，而是重新激活免疫系统识别和破坏肿瘤细胞的能力[]。目前免疫检查点抑制剂已经成为癌症领域最有前途的方法之一。在已发现的多种免疫检查点中，PD-1/PD-L1 被证明是导致慢性病毒感染和肿瘤患者 T 细胞免疫功能下降的原因之一[]。PD-1 是 T 细胞表面表达的免疫检查点之一，通过与其配体 PD-L1 或 PD-L2 的结合可诱导负性控制信号，从而抑制 T 细胞增殖、细胞因子产生，以及细胞毒性活性。基于阻断这些免疫检查点可以恢复免疫功能的原理，人们已经开发了针对 NSCLC 的各种抗 PD-1 抗体[]。

　　如今肺癌联合治疗策略有效地克服了肿瘤的耐药性，研究免疫检查点抑制剂（抗 PD-L1/PD-1 疗法）与其它免疫疗法组合的临床试验正在进行中，据近期数据统计全球目前共有 356 项关于肺癌联合免疫治疗研究[]。本研究鉴于 CIK 细胞属于 NK 样 T 细胞，因此推断通过阻断 PD-1 信号可增强 CIK 细胞的抗肿瘤效应。一系列研究证明了抑制性受体表达在 CIK 细胞上，阻断这些受体能够显著增强 CIK 介导的抗肿瘤细胞毒性反应。这些发现进一步证明了 PD-1/PD-L1 通路抑制剂联合 CIK 细胞介导的抗肿瘤效应成为了新的晚期恶性肿瘤的治疗策略[]。本研究通过体外诱导肺癌患者外周血单个核细胞获得 CIK 细胞群，其中 CD3+CD56+细胞亚群占总数的 31.58%±7.63%，这与 Ding 等[]的实验结果相近。在 PD-1 单克隆抗体联合 CIK 细胞培养和单独 CIK 细胞对肺癌细胞 A549 的杀伤实验中，得出不论是否与 PD-1 抗体共培养，CIK 细胞对肺癌细胞 A549 的杀伤都随着效靶比的增大而增大，证明了 CIK 细胞对肺癌细胞 A549 的杀伤效应存在着浓度依赖。与 PD-1 单克隆抗体联合培养的 CIK 细胞组与单独 CIK 细胞组相比，二者联合培养后在不同效靶比时均可增强 CIK 细胞对 A549 肺癌细胞的杀伤效应，差异具有统计学意义。通过检测各组 CIK 细胞穿孔素及颗粒酶表达水平和各组 CIK 细胞因子分泌水平，我们得出 PD-1 单克隆抗体联合 CIK 细胞培养后在穿孔素及颗粒酶表达水平、细胞因子分泌水平都比单独 CIK 细胞组要高，且差异具有统计学意义。免疫系统识别癌细胞表面表达特异性抗原后激活免疫效应细胞（主要是 T 淋巴细胞和 NK 细胞），NK 细胞和巨噬细胞产生 IL-2、IL-12 和 IFN-γ 杀死肿瘤细胞[]，其中 IL-2 等细胞因子还对维持细胞毒性 T 淋巴细胞的活性起重要作用[]。CD8+细胞毒性 T 细胞通过产生 IFN-γ、TNF-α 和颗粒酶等杀伤肿瘤细胞[]。NSCLC 免疫应答的初步研究证实 IL-2 和 TNF-α 等细胞因子对促进 NK 细胞活性和激活巨噬细胞这两个过程进而激活先天免疫至关重要[]。通过实验结果我们得知，PD-1 单克隆抗体联合 CIK 细胞培养较单独 CIK 细胞提高了分泌细胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）水平，这可能是 PD-1 单克隆抗体提高了 CIK 细胞抗肿瘤效应的原因。有研究[]表明 PD-1 与 PD-L1 结合后阻断了 IL-2 的合成和分泌，而前文我们得知 IL-2 对 T 细胞的活化和维持细胞毒性起重要作用，因此抗 PD-1 治疗后理应提高 IL-2 的分泌水平，与本文结果相符。也有研究[]通过 CIK 细胞 IFN-γ 因子释放实验进一步验证了阻断 PD-L1/PD-1 结合后提高 CIK 细胞 IFN-γ 分泌水平，进一步增强了杀伤肿瘤的能力。因此也有报道[]认为 IFN-γ 表达可以作为预测抗 PD-L1/PD-1 治疗效果的生物标志物。通过对 PD-1 单克隆抗体与 CIK 细胞联合培养后的检测，我们发现联合培养后的 CIK 细胞分泌多种细胞因子和抗肿瘤物质的水平都得到了明显的提高，因此我们认为，PD-1 单克隆抗体确实能够增加 CIK 细胞的杀瘤效应。

　　综上所述，通过利用 IFN-γ、抗 CD3 抗体、IL-2 细胞因子体外诱导扩增肺癌患者外周血单个核细胞能够获得具有抗肺癌效应的 CIK 细胞，大大提高了 CD3+CD56+细胞比例。本文实验得知 CIK 细胞对肺癌 A549 细胞的杀伤程度随效靶比的改变而改变。将 PD-1 单克隆抗体与 CIK 细胞联合培养后，CIK 细胞在同一来源、同一数量的情况下，提高了杀瘤效应，并且证明了 PD-1 单克隆抗体能够增强 CIK 细胞分泌穿孔素、颗粒酶以及细胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）的能力。本文为 PD-1 单克隆抗体能够增强 CIK 细胞抗肺癌肿瘤细胞效应这一理论提供了依据并进行了机制研究，但这并不代表能够与未来肺癌患者体内用药疗效一致，因为临床药物实验的药物浓度、不良反应以及用药时间等尚未确定，因此不能预测 PD-1 单克隆抗体联合 CIK 细胞在肺癌患者中的疗效，同时也缺少相应的检测来寻找适应人群和预测预后指标。

　　利益冲突：无。

　　作者贡献：刘通负责论文初稿撰写与数据收集；王贺双负责数据整理和分析；许凝负责论文总体设计。