金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白 A r10-11 截短体蛋白基因片段的原核表达与

　　金黄色葡萄球菌是一种人畜共患菌，广泛存在于自然界，如空气和土壤中，也存在于人和动物的皮肤以及与外界相通的腔道中，其不仅影响乳产品安全，也危害人体健康[]。在人群中有 20%～50% 鼻咽部带有病原型球菌，医院工作人员以及医疗器械带菌率很高，是医院内感染的重要来源；其可引起的疾病从皮肤、软组织感染到肺炎、脑膜炎、细菌性心内膜炎甚至危及生命的中毒性休克综合征，危害极大，临床上 80% 以上的皮肤化脓性疾病都是由金黄色葡萄球菌引起的[]。近百年来，国内外开展了各种关于金黄色葡萄球菌疫苗的研究，经历了从灭活全菌苗到亚单位疫苗再到 DNA 疫苗的 3 次转变，但是体外培养的金黄色葡萄球菌全菌灭活苗经过实验验证效果不理想，不能有效抵抗新的感染发生[]。而 DNA 疫苗刺激机体产生免疫应答反应较弱，而且有外源 DNA 整合入基因组的潜在危险，目前亚单位疫苗使用最为普遍而且效果较理想。已有研究发现，将金黄色葡萄球菌与免疫血清共同作用一段时间后，细菌与宿主的结合能力下降 92%，在体外也受到巨噬细胞吞噬[]。因此，制备金黄色葡萄球菌亚单位疫苗成为当下一个热点。

　　金黄色葡萄球菌释放黏附素，通过介质结合到细胞表面达到定植和侵染。纤连蛋白结合蛋白（fibronectin binding protein，FnBP）是金黄色葡萄球菌表面黏附素因子中的一种[]，能识别细胞外基质内配体纤连蛋白、纤维蛋白与弹性蛋白等，依次介导连接到细胞表面整合素，使细胞表面肌动蛋白重排，达到黏附作用[-]。故金黄色葡萄球菌分泌的黏附素是细菌感染的先决条件，抑制其活性可从根源上切断金黄色葡萄球菌感染。FnBP 分为 FnBPA 和 FnBPB，几乎所有金黄色葡萄球菌都能分泌 FnBPA，少数能共分泌 FnBPA 和 FnBPB[-]。故 FnBPA 已成为最近研究治疗与检测金黄色葡萄球菌感染的热点。

　　金黄色葡萄球菌 FnBPA 蛋白由 1 081 个氨基酸构成，N-端前 37 位氨基酸为信号肽，37-511 位氨基酸为连接弹性蛋白 EL 与纤维连接蛋白 Fg 区域，分为 N1、N2、N3 区；511-874 位氨基酸由 11 个重复序列构成（FnBPAr1-11），是 FnBPA 链接配体 Fn 的主要黏附区域（FnBPR）；874-948 位氨基酸为富含脯氨酸构成的 PRR 区域，类似于抗体铰链区，其功能有待于进一步研究；982–986 位氨基酸区域为 LPXTG 基序，C-端 948-1081 位氨基酸为连接细胞壁与细胞膜区域[-]。

　　根据 FnBPA 的蛋白二级结构分析，FnBPAr1-11 是连接其配体 Fn 的主要区域，而且每一个区域都能单独连接细胞基质内配体，11 个配体连接区域也分为强弱黏附区域，而 r10-11 都是强黏附区域[]。据此实验针对金黄色葡萄球菌的 FnBPAr10-11 蛋白基因进行诱导表达，表达金黄色葡萄球菌 FnBPAr10-11 截短体蛋白，并分离纯化，为后续动物免疫实验做好准备，同时也为后续的多联嵌合疫苗制备提供一定的依据。

　　金黄色葡萄球菌 Newman 株，大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）受赠于黑龙江八一农垦大学生命学院崔玉东教授；pET-32a 原核表达系统来源于四川大学华西医院卫生部重点实验室移植免疫研究室；限制性内切酶 BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA 连接酶、LA Taq DNA 聚合酶、DL8000、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside，IPTG）、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、氨苄青霉素、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸购自日本 TaKaRa 公司；蛋白质 Marker 购自立陶宛 Fermentas（MBI）公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇、溴酚蓝、脱脂乳购自美国 Ameresco 公司。细菌培养用胰胨及 Yerst Extract 购自英国 Oxoid 公司；Plasmid Miniprep Purification kit 和 Gal/PCRpurification kit 购自上海 Gene Tech 公司；酶联免疫斑点法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）试剂盒购自达科为公司。

　　实验用 81 只 BalB/C 雄性健康小鼠，体重 18～24 g，购自成都达硕公司，生产许可证为［SCXK（川）2015-30］，检验检疫合格证号为 No.51203500001021，动物饲养在四川大学华西医院动物实验中心无特定病原体屏障系统，使用许可证为［SYXK（川）2013-119］，温度 22～26℃，湿度 40%～70%，昼夜节律为 12 h，饲料为小鼠专用辐照全价日粮，自由采食饮水。动物实验已通过四川大学华西医院动物伦理委员会审查，符合动物伦理要求，伦理备案号为 2017101A。

　　根据 GenBank 中 FnBPA（GI:120457）中基因序列设计 2 条引物。上游引物：5′-CGC GGATCCAAGTATGAACATGGCG-3′；下游引物：5′-CAC AAGCTTAGGTGTTGTATCTTCTTC-3′。上游引物划线部分是 BamHⅠ酶切位点，下游划线部分为 HindⅢ酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　从–70℃ 冰箱中取出原始菌株金黄色葡萄球菌 Newman 并在胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板上划线过夜培养，挑取单菌落在 BST 液体培养基中 37℃，180 r/min 培养 12 h，后采用试剂盒提取金黄色葡萄球菌 Newman 全基因组。

　　以提取的金黄色葡萄球菌 Newman 的基因组为模板，按顺序依次加入模板 DNA（200 ng/μL）2.5 μL、上游引物（20 μmol/L）5 μL、下游引物（20 μmol/L）5 μL、DNA 聚合酶（5 U/μL）2.5 μL、dNTP 10 μL、10×Buffer 缓冲液 10 μL、无菌去离子水 65 μL 至 100 μL 体系。将 100 μL 体系平均分配到 PCR 管内，每个 PCR 管 20 μL 体系，同时设立阴性对照，并按以下过程进行 PCR 反应：94℃ 预变性 10 min，94℃ 变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 1 min；35 个循环，最后 72℃ 延伸 10 min。

　　将 PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶电泳进行验证，并将验证正确目的片段采用 Gal/PCR purification kit 试剂盒进行胶回收（具体步骤见说明书），回收后的目的基因在 1% 琼脂糖凝胶电泳进行验证。回收后的目的片段链接到 pMD-18T 载体上进行克隆，PCR 管内按顺序依次加入目的基因 fnbpAr10-11 4.5 μL、pMD-18T 载体 0.5 μL、solutionⅠ（含 T4 连接酶）5 μL 至 10 μL 体系。以上程序均在冰上进行。将混合后的 10 μL 体系在 16℃ 恒温连接仪上孵育2 h， 后转化到制备好的大肠杆菌 DH5α 感受态中。

　　转化过程如下：–70℃ 取出制备好的 DH5α 感受态冰上孵化，将链接混合物加入到感受态细胞内，放置在冰盒内 30 min，42℃ 热激 90 s，热激后再次放到冰盒内 1～2 min，此过程不能剧烈晃动感受态细胞，加入 37℃ 预热 LB 1 mL，之后 37℃ 空气摇床 110 r/min，培养 1 h，4 000 r/min 离心 5 min，弃去上清 800 μL，剩余的上清液混悬沉淀，取 200 μL 在含有 Amp+抗性的 LB 琼脂培养平皿上进行涂布，37℃ 过夜培养。

　　取阳性单菌落在还有 Amp+抗性的 LB 液体培养基内 180 r/min 培养 12 h，培养后的菌液采用 Plasmid Miniprep Purification kit 试剂盒提取质粒，提取后的质粒进行双酶切鉴定，按顺序依次加入 fnbpAr10-11-pMD-18T 质粒 10 μL、BamHⅠ 1 μL、HindⅢ 1 μL、10×Buffer 缓冲液 2 μL、无菌去离子水 6 μL 至 20 μL 体系。37℃ 水浴 15 min，后在 1% 琼脂糖凝胶电泳进行验证。

　　将阳性质粒 fnbpAr10-11-pMD-18T 用 BamHⅠ和 HindⅢ双酶切，之后用 1% 琼脂糖凝胶电泳进行验证，并回收双酶切后的目的片段，同时对表达载体 pET-32a 进行双酶切，并回收双酶切后载体片段。将双酶切后的目的片段和载体按 4∶1 比例进行连接：目的片段 4 μL，双酶切后 pET-32a 1 μL，含有 T4DNA 连接酶的 solutionⅠ 5 μL 至 10 μL 体系，并在 16℃ 恒温链接仪上连接 2 h，连接后产物转化到大肠杆菌 DH5α 中，具体步骤同 pMD-18T。并用含有 Amp+抗性的 LB 琼脂平板进行筛选。

　　挑取阳性单菌落接种到含有 Amp+抗性 LB 液体培养基中 37℃，180 r/min 培养 12 h，提取质粒，并用 BamHⅠ和 HindⅢ双酶切进行验证并留图。将鉴定正确的质粒转入到大肠杆菌 BL21（DE3）中，重组载体命名为 fnbpAr10-11-pET32a。同时将鉴定正确的菌株进行基因测序，测序由上海生工生物工程有限公司提供服务。

　　将筛选到的阳性重组菌 fnbpAr10-11-pET32a/BL21 以 1∶50 比例接种到含有 Amp+抗性 LB 液体培养基中 37℃ 过夜培养。取新鲜菌液以 1∶100 比例接种到含有 Amp+抗性 LB 液体培养基 100 mL 中，37℃ 180 r/min 培养至波长 600 nm 处吸光度（absorbance，A600）为 0.4～0.6，加入终浓度为 1.0 mmol/L 诱导剂 IPTG，37℃ 诱导 4 h。同时设立阴性对照组空载体 pET-32a/BL21。分别取实验组与对照组诱导后菌液 2 mL，12 000 r/min 离心 2 min，弃去上清，并用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）80 μL 对沉淀菌体悬浮，加入 5×上样缓冲液（含二硫苏糖醇）20 μL 充分混匀，并在沸水浴中煮沸 10 min，使菌体破裂，取处理后样品 5 μL 进行 12% 的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE ）分析。

　　免疫组：根据统计学要求将 6 周龄 BalB/C 雄性小鼠随机分成 A、B、C 3 组，每组 27 只，饲养 1 周后，分别于第 0 天和第 21 天皮下注射 PBS-佐剂、FnBPA-佐剂、FnBPAr10-11-佐剂，剂量为 100 μg/只。每组分别于第 21 天和第 35 天时随机取 3 只小鼠，尾根采血，分离血清，待检测特异性抗体水平。

　　攻毒组：上面的免疫组，每组取出 20 只，分成 2 笼，每笼 10 只，分别于每只小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌 Newman 株 1×1010 CFU、金黄色葡萄球菌 Wood46 株 0.8×1010 CFU。观察 1 周，从攻毒后的 12 h 开始每天做记录。

　　抗原以 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 稀释，阴阳性血清分别以 1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200 稀释，进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），每个稀释度做 3 个重复。

　　用 FnBPA 蛋白抗原包被好的酶标板，间接 ELISA 测定 3 份 BalB/C 小鼠阴性血清 A450 值。每份血清做 3 个重复。

　　根据之前确定的最佳抗原浓度包被 ELISA 板，血清以 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000 倍稀释，进行间接 ELISA 试验，在 A450 分别检测实验组和对照组中实验小鼠初免后 21、35 d 的血清，每组 3 只。

　　于免疫后第 4 周每组取 4 只小鼠处死，分离脾脏淋巴细胞，用于细胞因子检测。使用达科为公司的 ELISPOT 试剂盒测定 FnBPA、FnBPAr10-11、PBS 组小鼠脾脏分泌白细胞介素（interleukin，IL）-4、γ-干扰素淋巴细胞的水平。

　　采用 SPSS 18.0 软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK-q 检验。检验水准 α=0.05。

　　以金黄色葡萄球菌 Newman 全基因组为模板进行 PCR 扩增，扩增后的产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，获得大小为 222 bp 目的片段，与设计长度一致（）。

　　将重组阳性质粒 fnbpAr10-11-pET32a 进行双酶切验证（BamHⅠ和 HindⅢ），将酶切后的产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，得到的两条目的条带分别为 5 900、222 bp，与预期效果相同（）。测序结果同金黄色葡萄球菌 Newman 全基因组进行 BLAST 分析，结果相同率为 100%，说明构建的重组质粒正确没有突变。

　　根据 1.6 中的方法，重组菌 fnbpAr10-11-pET32a/BL21 经 IPTG 诱导表达后进行全菌体 SDS-PAGE 分析，在相对分子质量为 33×103左右处有一明显增量条带，目的基因大小为 222 bp，表达蛋白相对分子质量约为 8.14×103，因表达载体 pET-32a 自身表达蛋白相对分子质量约为 25×103，所以得到目的片段相对分子质量为 33.1×103 。诱导前与诱导后有明显增加，表明 FnBPAr10-11 在 pET-32a 表达载体中成功大量表达，Immage scanner Ⅲ扫描并运用专业分析软件 Glyko Bandscan 对电泳图谱进行分析表明，得到目的条带相对分子质量 33.1×103与预期效果一样（）。

　　经分析抗原 1∶100 稀释，血清 1∶1 600 稀释时，阴性 A450 值在 0.2 以下，且 P/N 值最大，所以抗原最佳稀释度定为 1∶100，浓度为 10 μg/mL，血清最佳稀释度定为 1∶1 600。

　　经统计分析，3 份阴性血清的 A450 的平均值为 0.157 5，标准差为 0.040 6，因此 ELISA 阴阳性临界值等于 0.198 1，确定样品 A450≥0.198 1 判定为阳性。

　　经 ELISA 检测后，FnBPA 组和 FnBPAr10-11 组二免后抗体效价高者达 1∶128 000，PBS 组抗体效价未见明显上升，抗体效价结果见；以最佳包被浓度包被 ELISA 板，血清以最佳稀释度 1∶1 600 来稀释，测得 A450 数据见，抗体效价越高，A450 值越大，结果表明 FnBPA 组和 FnBPAr10-11 组与 PBS 组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

　　重组蛋白 FnBPAr10-11 免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌 IL-4 和 γ-干扰素的能力与全蛋白 FnBPA 组比较差异无统计学意义（P>0.05），与 PBS 比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见、。

　　各实验免疫组，在加强免疫 14 d 后用金黄色葡萄球菌 Newman、Wood46，以绝对致死量进行攻毒，攻毒后观察实验小鼠死亡情况并记录数据；FnBPAr10-11 实验组免疫保护率为 50%（Newman 株）和 50%（Wood46 株）。见。

　　金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰阳性球菌，既是人体皮肤和鼻腔的常见定植菌，也是引起人类临床感染的常见致病菌[]。其为社区、医院获得性细菌感染的主要原因，具有很强的致病作用和很高的致死率，即使在适当治疗情况下仍比其他细菌感染的病死率高。

　　人类化脓感染中金黄色葡萄球菌是最常见的病原菌之一，除了引起皮肤和软组织感染外，同时还能引起骨髓炎、肺炎、心内膜炎及败血症等全身性感染，导致患者住院时间延长和比较昂贵的医疗费用支出。随着抗菌药物在金黄色葡萄球菌感染治疗中的广泛应用，大量金黄色葡萄球菌耐药菌株出现，致使金黄色葡萄球菌抗药性增强，甚至抗菌药物治疗毫无效果，危害人类生命健康，所造成的影响不能小觑[]。此外金黄色葡萄球菌也是奶牛乳房感染的主要病原菌之一，感染后导致奶牛产奶量和奶品质下降，严重影响乳业及食品安全，给畜牧业带来巨大经济损失[]。

　　金黄色葡萄球菌感染机体后，能够产生一系列菌体表面相联的黏附分子和分泌到细胞外的黏附因子，进而定植在感染的组织并进行增殖，同时逃避宿主免疫防御，引起机体感染。FnBPA 是金黄色葡萄球菌产生的重要表面黏附分子之一，主要在金黄色葡萄球菌对数生长前期表达，能够与细胞外基质中的纤连蛋白、纤维蛋白原等组织成分结合，成为细菌与宿主细胞表面结合的桥梁，从而使细菌在宿主细胞上定植进而侵染宿主细胞[]。同时，金黄色葡萄球菌与 FnBPA 结合后可对细菌起到保护作用，进而逃避宿主防御。因此，FnBPA 在金黄色葡萄球菌感染中显得尤为重要。FnBPA 蛋白具有良好的免疫原性，是重要的疫苗候选抗原，但因分子量过大而不易在体外获得高水平表达，限制了其作为疫苗的应用。

　　本实验采用重组 PCR 方法成功构建表达截短蛋白 FnBPAr10-11 的重组菌株，通过抗体水平检测和细胞因子检测，该截短蛋白 FnBPAr10-11 的免疫原性同全蛋白 FnBPA 无明显差异，表明该截短体保留了蛋白 FnBPA 原来的活性及功能，免疫原性良好。同时通过 2 种金黄色葡萄球菌的攻毒试验可以看出，该截短体免疫保护作用大于 50%，保护效果良好。

　　金黄色葡萄球菌是一类携带多个有效抗原的病原微生物，包括 FnBP、Trap、ClfA、ClfB、Cna 等。虽然亚单位疫苗有较好的免疫保护性，但因抗原单一性，治疗效果片面，发展多联嵌合疫苗不仅可解决抗原单一性的问题，其同时还具有良好的免疫原性。然而有效完整的抗原蛋白量都较大，直接串联制成多联嵌合体，超出了表达载体的承载量，导致表达量过低构建失败。制作多联嵌合疫苗很重要的一点就是要串联的蛋白量尽可能小、同时又保留了蛋白的免疫原性，这样既能比较容易地得到重组菌株又有较好的免疫效果。本研究中的截短体蛋白 FnBPAr10-11 保留了该蛋白的主要免疫原性，为后续多联嵌合重组疫苗的构建奠定了一定基础。