BHLHE22在前列腺癌骨转移免疫治疗中的应用

　　bhlhe22在前列腺癌骨转移免疫治疗中的应用技术领域1.本发明涉及药物新用途的技术领域，具体涉及bhlhe22在前列腺癌骨转移免疫治疗中的应用。背景技术：2.前列腺癌(prostate cancer，pca)是男性常见的恶性肿瘤。美国男性恶性肿瘤中前列腺癌的发病率占第一位，我国前列腺癌发病率呈逐年增高的趋势。统计截止至2020年，全球范围内前列腺癌是男性中第二常见和第五大致死性癌症。前列腺癌的发病率保持稳定，但是在过去十年中，晚期前列腺癌的诊出率由3.9％提高至8.2％。骨是晚期前列腺癌最常见的转移部位，超过80％的晚期前列腺癌患者会发生骨转移。骨转移引发的骨相关并发症严重降低了晚期前列腺癌患者的生活质量和生存时间。目前针对前列腺癌骨转移的治疗主要以预防疾病进展、缓解临床症状为目标，治愈则很难实现。因此，抑制前列腺癌骨转移的发生，探究影响pca细胞发生发展和转移的内外源性因素，揭示其潜在的分子机制并开展针对性的治疗具有重要意义。3.目前针对晚期前列腺癌骨转移患者的新型治疗方式包括：以ar拮抗剂为代表的抗雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy，adt)、parp抑制剂等生物靶向治疗、镭-223和镥-177等放射性同位素治疗、双磷酸盐和地诺单抗等骨靶向药物治疗以及免疫治疗。目前，以免疫检查点抑制剂(immune checkpointtherapy，ict)为代表的免疫疗法已被证实对多种实体瘤有效。然而，前列腺癌骨转移患者的肿瘤细胞内源性分子特征和肿瘤微环境特有的免疫抑制状态导致ict无法有效改善前列腺癌骨转移患者的预后。因此，揭示pca细胞内源性的治疗抵抗机制、解除前列腺癌骨转移患者的肿瘤免疫抑制微环境、提高免疫治疗疗效具有极大的临床意义。4.转录因子(transcription factors，tf)是一类具有调控基因表达功能的基因，其在不同时间空间中的表达影响了细胞多种生理过程并决定了细胞命运。既往的研究报道中，在神经发育相关研究领域bhlhe22被证明通过形成转录复合物转录调控基因表达。然而在肿瘤研究领域，目前尚未有关bhlhe22功能的研究报道。技术实现要素：5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供bhlhe22在前列腺癌骨转移免疫治疗中的应用。6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种分子标志物在预测或检测前列腺癌骨转移中的应用，所述分子标志物为bhlhe22；所述应用为非疾病诊断和治疗的应用。7.bhlhe22是螺旋-环-螺旋结构(bhlh)转录因子b类超家族成员，位于8号染色体q12.3。bhlhe22主要在胰腺、端脑和小脑组织中表达，是典型的组织特异性表达基因。mdscs是未发育成熟的、没有分化为巨噬细胞、中性粒细胞或树突状细胞的髓系祖细胞异质性群体。mdscs通过多种机制抑制抗肿瘤免疫反应。本技术发明人经研究发现，转录因子bhlhe22在骨转移pca中表达上调，诱导骨微环境内mdscs的积聚，驱动免疫抑制微环境形成，促进了pca骨转移。因此，通过对组织中bhlhe22表达的检测可以预测或检测前列腺癌骨转移。8.本发明还提供bhlhe22在制备用于预测或检测前列腺癌骨转移的产品中的应用。9.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述产品包括检测样本中bhlhe22的表达量的试剂。10.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述样本中bhlhe22的表达量上调。11.本技术发明人研究发现，bhlhe22在伴有骨转移的前列腺癌原发灶中表达上调，骨转移组织中进一步表达上调，并且bhlhe22表达上调与前列腺癌患者不良的临床预后呈显著正相关，包括总体生存期和无骨转移生存期。因此，通过对前列腺癌原发灶或骨转移组织的bhlhe22表达的检测，可以预测或检测前列腺癌骨转移。12.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述试剂包括通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测或芯片检测bhlhe22表达水平的试剂。13.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述检测的样本是人体组织样本。14.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述人体组织样本为前列腺癌原发灶或骨转移组织。15.本发明还提供一种用于预测或检测前列腺癌骨转移的试剂盒，所述试剂盒含有能检测bhlhe22的表达量的试剂。16.骨微环境具有利于转移性肿瘤细胞定植与生长的特性。骨髓微环境通过多种机制促使播散肿瘤细胞发生免疫逃逸，导致耐药和复发。骨转移pca属于“冷”肿瘤，富含免疫抑制性细胞因子；同时又有大量的treg细胞和mdscs浸润并且缺乏apc、nk、th1、cd8+ t细胞。因此，缓解免疫抑制性细胞群体介导的免疫抑制作用，激活效应免疫细胞功能的治疗策略具有良好的应用前景。本技术发明人研究发现，高bhlhe22表达的pca细胞诱导了mdscs的扩增和浸润，mdscs耗竭cd4+ t和cd8+ t细胞，形成免疫抑制骨微环境，促进前列腺癌骨转移。因此，通过下调bhlhe22的表达，降低mdscs浸润，抑制前列腺癌骨转移。17.csf2是由作为细胞因子起作用的巨噬细胞，t细胞，肥大细胞，自然杀伤细胞，内皮细胞和成纤维细胞分泌的单体糖蛋白。本技术发明人研究发现，bhlhe22通过与csf2启动子结合转录激活csf2的表达。通过实验发现，anti-csf2联合ict治疗能显著提高ict的治疗疗效，降低bhlhe22+ pca细胞诱导的mdscs扩增和浸润，减少cd4+ t和cd8+ t细胞耗竭，活化cd8+ t细胞，解除骨免疫抑制微环境。18.本发明还提供gsk3326595联合pd-1抑制剂在制备用于预防及治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用。19.本发明还提供一种用于预防及治疗前列腺癌骨转移的药物组合物，所述药物组合包含以下物质：(1)prmt5拮抗剂gsk3326595；(2)pd-1抑制剂pembrolizumab。20.prmt5全称为蛋白质精氨酸甲基转移酶5，是一种表观遗传修饰剂，可催化组蛋白和非组蛋白上精氨酸残基的单甲基化和对称二甲基化，调节多种细胞过程，参与了癌症的形成和进展。本技术发明人研究发现，bhlhe22与prmt5相互结合，prmt5通过催化组蛋白h4r3me2a和h3r2me2s位点甲基化，转录激活csf2的表达。通过实验发现，prmt5拮抗剂gsk3326595联合ict治疗均能显著提高ict的治疗疗效，降低bhlhe22+pca细胞诱导的mdscs扩增和浸润，减少cd4+ t和cd8+ t细胞耗竭，活化cd8+ t细胞，解除骨免疫抑制微环境。21.本发明的有益效果：本发明提供了bhlhe22在前列腺癌骨转移免疫治疗中的应用。本发明证实了bhlhe22表达上调促进前列腺癌骨转移和bhlhe22驱动形成的前列腺癌骨转移免疫抑制微环境；本发明揭示了bhlhe22/prmt5/csf2通路驱动形成免疫抑制骨微环境，促进前列腺癌骨转移的重要作用。本发明将bhlhe22应用于前列腺癌骨转移免疫治疗，不仅为制备预防及治疗前列腺癌骨转移的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了bhlhe22新的医药价值。附图说明22.图1：a为pca/nbm(n＝132)、pca/bm(n＝60)、bm(n＝30)中bhlhe22表达量的代表性ihc染色结果及定量分析。比例尺，100um和50um.*p《0.05，***p《0.001。one-way anova；b为基于gse77930测序结果，bhlhe22在转移性骨组织、原发灶前列腺及其他脏器转移部位中的表达水平。***p《0.001。one-way anova；c为基于tcga-prad数据库分析，pca/nbm和pca/bm中bhlhe22的表达水平。**p《0.01。mann-whitney检验；d为基于tcga-prad数据库数据，kaplan-meier分析低bhlhe22表达(0～33％分位数)和高bhlhe22表达(66～100％分位数)pca患者的无病生存率生存曲线。p＝0.012，log-rank检验；e为kaplan-meier分析低bhlhe22表达(0～50％分位数)和高bhlhe22表达(50～100％分位数)pca患者的总体生存率生存曲线。p＝0.007，log-rank检验；f为kaplan-meier提示低bhlhe22表达(0～50％分位数)和高bhlhe22表达(50～100％分位数)pca患者的无骨转移生存率生存曲线。p＝0.005，log-rank检验。23.图2：a-c为左心室注射rm-1细胞后，balb/c裸鼠骨转移模型bli信号监测和h&e染色切片图像及定量结果。ns，不显著。t检验；d-f为左心室注射pc-3细胞后，balb/c裸鼠骨转移模型bli信号监测和h&e染色切片图像及定量结果。ns，不显著。t检验；g为代表性的左心室注射rm-1细胞c57bl/6j小鼠骨转移模型bli信号监测结果图像；h为代表性的c57bl/6j小鼠骨转移病变microct图像(箭头指示溶骨性病变)。比例尺，1mm；i为代表性的c57bl/6j小鼠股骨/胫骨h&e染色切片图像(t,肿瘤；n,邻近非肿瘤组织)。比例尺，200μm和50μm；j为microct溶骨面积量化结果。***p《0.001。t检验。(k)h&e染色肿瘤病变范围量化结果。***p《0.001。t检验；l为kaplan-meier法分析各组c57bl/6j小鼠总体生存率生存曲线；m为kaplan-meier法分析各组c57bl/6j小鼠无骨转移生存率生存曲线。p＝0.001(l)，p＝0.004(m)。log-rank检验。24.图3：a为ucsc数据库显示，bhlhe22位于8号染色体，采用phylop算法计算了bhlhe22在进化过程中不同物种之间的序列保守性评分(黑色柱子表示序列一致，灰色柱子表示序列不一致。双横线表示序列缺失)；b-c为rm-1和pc-3细胞的transwell迁移/侵袭实验结果及定量统计。ns，不显著。one-way anova；d-e为基于tcga-prad数据库和rna-seq结果的基因集富集分析(gsea)显示高bhlhe22表达中富集的免疫负性调控相关通路；f为rna-seq结果的gene ontology分析，高bhlhe22表达中免疫应答基因集在top10富集。25.图4：a-b为前列腺癌人体组织样本pca/bm(a)和bm(b)中bhlhe22、dapi染色及cd33+ mdscs、cd8+ t细胞浸润的代表性多标组织免疫荧光染色图像。样本按低(0～50％分位数)和高(50～100％分位数)bhlhe22表达进行分层。比例尺，50um；c为左心室注射rm-1细胞的c57bl/6j小鼠骨转移骨髓切片cd4+ t、cd8+ t、gr-1+ mdscs细胞浸润的代表性多标组织免疫荧光染色图像。比例尺，50um；d-e为前列腺癌人体组织样本pca/bm(d)和bm(e)中每高倍视野(200×)的cd33+mdscs和cd8+ t细胞数量的定量结果。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。t检验；f为左心室注射rm-1细胞的c57bl/6j小鼠骨转移骨髓切片中每高倍视野(200×)的cd33+ mdscs以及cd4+ t、cd8+ t细胞数量的定量结果。**p《0.01,***p《0.001。t检验；g-h为多色流式细胞检测结果显示，c57bl/6j小鼠骨转移骨髓肿瘤浸润cd45+7aad-细胞(g)和cd3+cd11b-细胞(h)比例和定量结果。ns，不显著。t检验；i为多色流式细胞检测结果显示，c57bl/6j小鼠骨转移骨髓肿瘤浸润cd11b+gr-1+(mdscs),ly6c+ly6glo(m-mdscs),ly6c-ly6g+(pmn-mdscs)和gr-1+arg-1+细胞的比例；j为肿瘤浸润mdscs,m-mdscs,pmn-mdscs和arg-1+mdscs的定量结果。*p《0.05，***p《0.001。t检验；k为多色流式细胞检测结果显示，c57bl/6j小鼠骨转移骨髓肿瘤浸润cd4+ t,cd8+ t,ifn-γ+cd8+ t和pd-1+cd8+ t细胞的比例；l-m为肿瘤浸润cd4+ t,cd8+ t细胞(l)和ifn-γ+cd8+ t，pd-1+cd8+ t细胞(m)的定量结果。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。t检验；n-o为从bhlhe22+ bm小鼠中分选的mdscs和cd8+ t共培养5天后,多色流式细胞术检测和定量分析t细胞增殖抑制结果(cfse染色)。***p《0.001。one-way anova。26.图5：a-b为多色流式细胞检测体内mdscs耗竭试验中肿瘤浸润cd11b+gr-1+(mdscs)细胞(a)和cd4+ t,cd8+ t细胞(b)比例和定量结果。***p《0.001。t检验；c-f为多色流式细胞检测结果显示，c57bl/6j小鼠骨转移骨髓肿瘤浸润treg细胞(c)、nk细胞(d)、巨噬细胞(e)、tam-1和tam-2细胞(f)比例和定量结果。ns，不显著。t检验。27.图6：a为rm-1和pc-3细胞系(bhlhe22 vs vector)的rna-seq结果，火山图显示差异表达基因(fc＞1.5)；b为rm-1-bhlhe22和rm-1-vector细胞培养上清多因子蛋白芯片检测分析；c-d为western blotting检测rm-1、pc-3细胞系和bhlhe22组c57bl/6j小鼠bm肿瘤组织中的csf2表达；e为左心室注射rm-1细胞的c57bl/6j小鼠骨转移骨髓切片bhlhe22、csf2、dapi染色及gr-1+ mdscs细胞浸润的的代表性多标组织免疫荧光染色图像(200×)以及csf2表达定量。比例尺，50um。***p《0.001。t检验；f为左心室注射rm-1细胞的c57bl/6j小鼠骨转移骨髓切片中bhlhe22、cd4+ t(cd4)、cd8+ t(cd8)、mdscs(gr-1和s100a9)、csf2和ki-67的代表性免疫组化染色图像。比例尺，50um；g为每高倍视野阳性细胞数免疫组化染色统计结果(400×)。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。t检验；h为ki-67免疫组化染色评分统计结果。**p《0.01。t检验；i为csf2+与gr-1+细胞相关性分析。r＝0.645,p《0.001；spearman检验；j为tcga-prad数据库csf2与bhlhe22表达的相关性分析。r＝0.230,p《0.001；spearman检验。28.图7：a-b为代表性的左心室注射rm-1细胞后各实验组c57bl/6j小鼠骨转移模型bli信号监测和h&e染色结果；c-d为骨转移bli信号和肿瘤病灶免疫统计结果。ns,不显著，*p《0.05,***p《0.001。one-way anova；e为多色流式细胞术检测各实验组中体内mdscs浸润分析及统计结果。ns,不显著。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。one-way anova；f为多色流式细胞术检测各实验组中体外mdscs扩增的共培养试验及统计结果(cfse染色)。ns,不显著。***p《0.001。one-way anova。29.图8：a为双荧光素酶报告基因检测csf2启动子活性。标准化为萤火虫荧光素酶活性相比于renilla荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶活性/renilla荧光素酶活性)。***p《0.001。one-way anova；b-c为chip-qpcr分析过表达bhlhe22后rm-1(b)和pc-3(c)细胞中bhlhe22与csf2启动子序列共沉淀结果。***p《0.001。one-way anova；d为人和小鼠中bhlhe22的dna-binding motif图例；e为co-ip试验的洗脱液跑胶银染图像、质谱(ms)分析以及潜在的与bhlhe22相互作用的转录共因子。红色箭头指示prmt5；f为jaspar数据库中预测的bhlhe22在csf2启动子区域的结合位点；g为csf2启动子dna探针图例与dna pull-down试验的洗脱液跑胶银染图像。红色箭头指示prmt5；h为western blotting检测dna pull-down试验洗脱液中prmt5的表达；i为细胞免疫荧光染色检测rm-1-bhlhe22细胞系中bhlhe22和prmt5共定位情况。比例尺，25um；j为双荧光素酶报告基因检测转染pgl4-fl-bbs或pgl4-p1-bbs-wt或pgl4-p1-bbs-mut的rm-1-bhlhe22细胞(内源性试验)和hek293t细胞(外源性试验,同时转染bhlhe22过表达载体质粒)中的csf2启动子活性。标准化为萤火虫荧光素酶活性相比于renilla荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶活性/renilla荧光素酶活性)。***p《0.001。one-way anova；k-l为内源性(k)和外源性(l)免疫共沉淀试验(co-ip)检测bhlhe22与prmt5的相互作用。外源性试验中，flag标记bhlhe22，ha标记prmt5；m为qpcr检测rm-1和pc-3细胞过表达bhlhe22后prmt5的表达水平。ns,不显著。t检验；n为chip-qpcr分析bhlhe22和prmt5与csf2启动子共沉淀结果及bhlhe22/prmt5复合物结合csf2启动子的模式图。***p《0.001。one-way anova。30.图9：a为敲减prmt5后，qpcr检测csf2的表达水平。***p《0.001。one-way anova；b为敲减prmt5后，western blotting检测csf2的表达水平；c为western blot检测h4r3,h3r2和h3r8组蛋白位点甲基化水平；d为chip-qpcr分析敲减prmt5后h4r3,h3r2和h3r8甲基化抗体与csf2启动子共沉淀结果。***p《0.001。t检验；e为prmt5抑制剂gsk591处理后，qpcr检测csf2的表达水平。***p《0.001。one-way anova；f为prmt5抑制剂gsk591处理后，western blotting检测csf2的表达水平；g为chip-qpcr分析prmt5抑制剂gsk591处理后h4r3,h3r2和h3r8甲基化抗体与csf2启动子共沉淀结果。***p《0.001。t检验；h-i为代表性的左心室注射rm-1细胞后各实验组c57bl/6j小鼠骨转移模型bli信号监测和h&e染色图像，骨转移病灶bli信号强度和肿瘤面积的统计结果。ns,不显著，*p《0.05,***p《0.001。one-way anova；j为多色流式细胞术检测各实验组中体内mdscs浸润分析及统计结果。ns,不显著。***p《0.001。one-way anova；k为多色流式细胞术检测各实验组中体外mdscs扩增的共培养试验及统计结果(cfse染色)。ns,不显著。***p《0.001。one-way anova。31.图10：a为抗csf2联合ict治疗的实验方案和分组图例，igg组(n＝10)、抗csf2组(n＝10)、抗pd-1组(n＝10)和抗csf2联合pd-1治疗组(n＝10)；b为代表性的骨转移病灶bli信号监测图像；c为代表性的骨转移病变microct图像(箭头指示溶骨性病变)。比例尺，1mm。代表性的h&e染色图像(t,肿瘤；n,邻近非肿瘤组织)。比例尺，200μm和50μm。代表性的ki-67免疫组化染色图像。比例尺，50um；d为各实验组的骨转移发生率。***p《0.001。卡方检验；e为各实验组的骨转移病灶bli信号强度统计结果。ns,不显著，***p《0.001。one-way anova；f为microct溶骨面积量化结果。ns,不显著，*p《0.05,***p《0.001。one-way anova；g为h&e染色肿瘤病变范围量化结果。ns,不显著，**p《0.01,***p《0.001。one-way anova；h-i为各实验组的小鼠总体生存率生存曲线(h)和无骨转移生存率生存曲线(i)。ns,不显著，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。log-rank检验；j为ki-67免疫组化染色评分统计结果。ns,不显著，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。one-way anova。32.图11：a为多色流式细胞术检测各实验组中骨转移瘤内mdscs浸润比例及统计结果。ns,不显著。***p《0.001。one-way anova；b为多色流式细胞术检测各实验组中骨转移瘤内cd4+ t和cd8+ t细胞浸润比例及统计结果。ns,不显著，*p《0.05,***p《0.001。one-way anova；c为多色流式细胞术检测各实验组中骨转移瘤内ifn-γ+cd8+ t细胞浸润比例及统计结果。ns,不显著。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。one-way anova。33.图12：a为gsk3326595联合ict治疗的实验方案和分组图例，igg组(n＝10)、gsk3326595组(n＝10)、抗pd-1组(n＝10)和gsk3326595联合pd-1治疗组(n＝10)；b为代表性的骨转移病灶bli信号监测图像；c为代表性的骨转移病变microct图像(箭头指示溶骨性病变)。比例尺，1mm。代表性的h&e染色图像(t,肿瘤；n,邻近非肿瘤组织)。比例尺，200μm和50μm。代表性的ki-67免疫组化染色图像。比例尺，50um；d为各实验组的骨转移发生率。***p《0.001。卡方检验；e为各实验组的骨转移病灶bli信号强度统计结果。ns,不显著，***p《0.001。one-way anova；f为microct溶骨面积量化结果。ns,不显著，*p《0.05,***p《0.001。one-way anova；g为h&e染色肿瘤病变范围量化结果。ns,不显著，**p《0.01,***p《0.001。one-way anova；h-i为各实验组的小鼠总体生存率生存曲线(h)和无骨转移生存率生存曲线(i)。ns,不显著，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。log-rank检验；j为ki-67免疫组化染色评分统计结果。ns,不显著，*p《0.05,***p《0.001。one-way anova。34.图13：a为多色流式细胞术检测各实验组中骨转移瘤内mdscs浸润比例及统计结果。ns,不显著。***p《0.001。one-way anova；b为多色流式细胞术检测各实验组中骨转移瘤内cd4+ t和cd8+ t细胞浸润比例及统计结果。ns,不显著，***p《0.001。one-way anova；c为多色流式细胞术检测各实验组中骨转移瘤内ifn-γ+cd8+ t细胞浸润比例及统计结果。ns,不显著。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。one-way anova。35.图14：a为ihc检测人体pca骨转移组织样本中bhlhe22的表达情况。0分(-),1-4分(+)，5-8分(++)，9-12分(+++)；b为人体pca骨转移组织样本中，代表性的prmt5染色结果及评分统计。比例尺，50um。ns,不显著。t检验；c为ihc检测人体pca骨转移组织样本中，cd4+ t(cd4)、cd8+ t(cd8)细胞和mdscs(cd33)的浸润情况，以及bhlhe22、csf2、ki-67染色图像。比例尺，50um；d为cd4+ t、cd8+ t细胞和mdscs浸润的统计结果。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。t检验；e为ihc检测csf2表达的统计结果。***p《0.001。t检验；f为ki-67染色评分的统计结果。**p《0.01。t检验；g-j为bhlhe22与cd4+ t细胞(r＝-0.585,p《0.001)、cd8+ t细胞(r＝-0.593,p《0.001)、mdscs(r＝0.688,p《0.001)浸润、csf2表达(r＝0.678,p《0.001)的相关性分析。spearman检验；k为bhlhe22驱动形成免疫抑制骨微环境促进pca骨转移的相关分子机制示意图。具体实施方式36.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。37.实施例138.1、材料和方法39.(1)细胞培养40.前列腺癌细胞系pc-3和rm-1从中国科学院上海细胞库购入。pc-3细胞系在10％fbs的rpmi-1640培养基中培养，并加入1％的双抗(100mg/ml青霉素，100mg/ml链霉素)。rm-1细胞系在10％fbs的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中培养，同时加入1％的双抗(100mg/ml青霉素，100mg/ml链霉素)。培养箱孵育条件为：5％二氧化碳(co2)，37℃。定期在显微镜下观察细胞形态，视情况定期更换培养基，选用70-90％融合度细胞进行体内外实验。41.(2)质粒、质粒转化和质粒提取42.质粒：将人源bhlhe22(nm_152414.5)cdna通过pcr扩增并克隆到pcdh-puro质粒载体(pcdh-bhlhe22-puro-flag)，pcdh-puro质粒载体用作对照。将鼠源bhlhe22(nm_021560.4)cdna通过pcr扩增并克隆到plvx-hyg质粒载体(plvx-bhlhe22-hyg-flag)，plvx-hyg质粒载体用作对照。质粒转化：取出感受态大肠杆菌冰上解冻，吸取50ul悬液加入1.5ml ep管，加入目标质粒溶液5ul(含量不超过50ng,体积不超过10μl)，42℃水浴90秒,迅速冰上静置2min，ep管内加入600μl lb液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1h(225rpm)。离心、重悬、涂板(含amp的lb琼脂平板)，37℃倒置培养12-16小时。挑选单克隆菌落加入1.5ml ep管(含amp的lb培养基)。37℃振荡培养6h(225rpm)。15％甘油，-80℃保存菌种。43.质粒提取：采用transgen质粒小提(hipure plasmid miniprep kit)和大提(hipure plasmid maxiprep kit)kits并按试剂盒说明书操作进行质粒小提和大提。实验方法如下：-80℃冰箱中取出菌种，10ul枪头挑取少量菌种加入1.5ml ep管(含amp的lb培养基)，活化菌种(37℃，225rpm摇1小时)，吸取200-500ul活化的菌液加入15ml离心管(含amp的lb培养基，小提)或100ml锥形瓶(含amp的lb培养基，大提)，小摇或大摇质粒(37℃，225rpm摇12-16小时)。菌液充分浑浊后12000×g离心2min，去上清，先后加入试剂盒内的rb、lb、nb，12000×g离心15min，吸取上清加入离心柱(分多次过柱)，8000×g离心2min，先后加入试剂盒内tb、wb，8000×g离心5min，室温放置10min，加1-2ml去离子水，8000×g离心2min洗脱dna，测定质粒浓度，-20℃保存。44.(3)细胞转染45.消化对数生长期细胞并重悬计数后，5.0×105个细胞/孔铺到6孔板中，24小时后待细胞融合度为70％-80％时，更换细胞培养液为无血清的opti-mem培养基并开始转染实验。准备两个无菌的1.5ml ep管，计算质粒浓度，a管加入125μl opti-mem+7.5μl lipofectamine 3000；b管加入125μl opti-mem+5μl p3000+2.5μg质粒；室温孵育5分钟后，将a和b管试剂混合，室温下再次孵育20分钟，加入6孔板，来回晃动培养板，细胞放回培养箱继续培养。转染48小时后，提取细胞rna验证质粒的转染效率，并进行下一步实验。46.(4)构建稳定株细胞47.转染前1天将293t细胞接种在10cm细胞培养皿，使转染当天达到70％-80％融合度并更换细胞培养液为无血清的opti-mem培养基。准备两个无菌的1.5ml ep管，计算质粒浓度，a管加入125μl opti-mem+36μl lipofectamine 3000；b管加入125μl opti-mem+24μl p3000+3μg重组质粒和9ug病毒包装质粒混合物；室温孵育5分钟后，将a和b管试剂混合，室温下再次孵育20分钟，加入10cm细胞培养皿，来回晃动培养皿，细胞放回培养箱继续培养。转染24小时后，更换为含10％fbs的dmem培养基。转染48-72小时后收获含病毒上清液。离心、过滤后储存在-80℃冰箱。48.消化对数生长期细胞并重悬计数后，按5.0×105个细胞/孔的数量，将pc-3和rm-1细胞铺到6孔板中培养,待细胞融合度达到50-60％，更换培养基并加入polybrene(浓度为5μg/ml)。计算每孔需加入的病毒液量，计算公式为：(细胞数×moi值/病毒原液滴度)×103。pc-3细胞系的moi值为10，rm-1细胞系的moi值为100。感染24小时后更换新鲜培养基。传代培养后，用2ug/ml浓度的含嘌呤霉素(puro)培养基或用200ug/ml浓度的含潮霉素(hyg)培养基筛选阳性细胞，连续筛选5-7天后，提取细胞rna验证转染效率，传代冻存并进行下一步实验。49.(5)蛋白免疫印迹50.提取细胞蛋白：吸净细胞培养皿内培养基，用预冷的pbs清洗两遍后，将培养皿置于冰上并加入细胞裂解液。用预冷的细胞刷来刮取细胞，收集裂解液至1.5ml ep内(超声破碎细胞核，可选)。测定蛋白浓度后，加入蛋白变性剂(5％巯基乙醇)，充分混匀后，98℃变性10min备用或直接放入-80℃保存。提取组织蛋白：组织剪碎称重后，按照100mg/1ml加入裂解液(50ul体系：40ul ripa+5ul蛋白酶抑制剂+5ul磷酸酶抑制剂+0.5ul pmsf)，清洗匀浆器头后，用组织匀浆器制备组织匀浆，并转入1.5ml ep管内，冰上裂解30min。4℃，12000rpm/min，离心10-15min。收集上清至1.5ml ep内，测定蛋白浓度后，98℃变性10min备用或直接放入-80℃保存。配制分离胶和浓缩胶。每条泳道中加入20-30μg蛋白样品。80v恒压电泳约1小时，300ma恒流转膜2小时，使蛋白转移至pvdf膜上。用5％脱脂牛奶封闭45分钟，同时配制一抗(按不同抗体的要求，配置不同浓度)。封闭后加入配置好的一抗，置于4℃摇床上孵育过夜。12-18小时后从冷库中取出，tbst漂洗3次，每次10分钟。配置一抗相同种属来源的二抗(按1:3000比例配置)，室温孵育45分钟，tbst漂洗3次，每次10分钟。随后至暗室压片，曝光显影。依据不同实验需求，选用合适的内参蛋白来归一化蛋白表达。51.(6)rna的提取52.使用ezbioscience rna提取试剂盒(ez-press rna purification kit)提取rna，步骤如下：a.样品裂解：弃掉培养基，pbs清洗细胞，每份样品加入500μl裂解液，吹打混匀，充分裂解细胞后转移至新的ep管内。b.rna结合：向裂解产物内加入等体积的无水乙醇，充分混匀，转移至离心柱内，4000×g离心1min。c.dnase处理：向10ul双蒸水中加入2ul gdna remover，转移至离心柱内。d.洗涤：离心柱中加入500μl洗涤液，12000×g离心1min，转移离心柱到新的1.5ml ep管(无rna酶)中。rna洗脱：向离心柱中加入20-30μl洗脱液，室温孵育2分钟，12000×g离心1min，弃去离心柱，测定所得rna浓度，储存于-80℃冰箱备用。53.(7)逆转录和实时定量pcr(rt-qpcr)54.逆转录rna：ezbioscience rna逆转录试剂盒(color reverse transcriptionkit)进行rna的逆转录实验gdna remover处理rna：100ng-2u的rna中加入2ul gdna remover，充分混匀，反应5min。配制逆转录反应体系：准备无酶pcr管，按下表配置反应体系，吹打混匀。55.成分体积(20μl体系)gdna remover处理过的总rna上述体积(xμl)4x rt master mix5μlnuclease free ddh2o补足到20μl56.逆转录反应条件：42℃反应15min，95℃反应30s，收集储存cdna于-80℃冰箱备用。实时定量pcr：2x color sybr green qpcr master mix试剂盒进行实时定量pcr。取出制备好的cdna，置于冰上，按下表配置反应体系，吹打混匀，贴膜封板，离心后放入实时定量pcr仪。57.成分20μl体系2x color sybr green qpcr master mix10μl正向引物(10μm)0.4μl反向引物(10μm)0.4μlcdna2μlddh2o补足到20μl58.扩增条件：95℃预变性5min。随后，95℃解链15s，60℃退火延伸45s，共执行40个循环。gapdh用作内参基因来归一化。所有引物序列见表1。59.表1 rt-pcr引物序列[0060][0061][0062](8)免疫组化(ihc)[0063]本实验均采用石蜡切片样本，免疫组化实验选用中杉金桥试剂盒进行，具体步骤如下：60℃烤箱内烤片(2-3h)；二甲苯脱蜡(5min×3次)；水化(100％乙醇×2次，95％乙醇×1次，75％乙醇×1次；每次3min)；去除内源性过氧化氢酶(3％h 2 o 2 37℃，摇床15min)；柠檬酸修复液内微波修复(高火5min，中火20min，自然冷却)；甩干后，用组化笔画圈；破膜(含0.3％triton x-100的pbs孵育15-30min，可选)；pbs-t漂洗2次，pbs漂洗1次；切片放置于湿盒内，室温下封闭液封闭30min(a液，山羊抗兔封闭液)；弃封闭液加一抗(一抗用抗体稀释液稀释)，4℃孵育过夜(12-24小时)；从冷库取出湿盒，复温30min，pbs-t漂洗3次；加b液孵育30min(生物素标记的羊抗鼠/兔igg)；pbs-t漂洗2次，pbs漂洗1次；加c液孵育30min(链霉亲和素-过氧化物酶)；pbs-t漂洗2次，pbs漂洗1次；显微镜观察下dab显色(摸索最佳浓度和时间)；双蒸水漂洗，中止dab显色；苏木素染色1-2min；95％盐酸酒精分化10s；返蓝(自来水漂洗30-45min)；显微镜观察下苏木素染色效果；脱水(60％乙醇、80％乙醇、100％乙醇分别脱水3min)；二甲苯置换酒精(5min×3次)；放置于通风橱通风过夜；中性树脂封片。显微镜下分别计算阳性细胞百分比和染色强度给予ihc评分。阳性细胞百分比：0分(《5％)，1分(5％–25％)，2分(25％–50％)，3分(50％–75％)，4分(》75％)。染色强度：0分(无染色)，1分(淡黄色)，2分(棕黄色)，3分(棕褐色)。ihc评分公式＝阳性细胞百分比评分×染色强度评分。0分为阴性(-),1-4分为弱阳性(+)，5-8分为中度阳性(++)，9-12分强阳性(+++)。[0064](9)迁移和侵袭实验[0065]提前将matrigel胶取出放入4℃冰箱过夜。侵袭实验用50mg/ml的matrigel胶，包被transwell小室polycarbonate滤膜(6.5mm transwell，8um孔径)，迁移实验无需包被matrigel胶。transwell小室内加入200μl无血清培养基，下室中加入500μl含10％fbs的完全培养基。消化并收集对数生长期细胞，按1×105个细胞/ml密度向transwell小室铺入细胞，培养箱内培养24-48h。去除小室中的胶体(迁移实验无该步骤)，加入1ml 4％多聚甲醛固定30min，pbs漂洗一遍，结晶紫染色10-20min，自来水漂洗干净，用棉签擦去小室上层细胞，晾干过夜。第二天显微镜下观察倒置的transwell小室，拍照计数穿过的细胞数量。[0066](10)动物实验及药物处理[0067]动物实验福利和伦理均由中山大学实验动物管理与伦理委员会批准(批准编号sysu-iacuc-2022-000178)。中山大学何母楼实验动物屏障中心(syxk粤2019-0209)完成动物饲养及相关实验。实验所用4-6周龄c57bl/6j和balb/c-nu小鼠均购买自江苏集萃药康生物科技有限公司。造模及评价骨转移状态：本实验在2％异氟烷吸入麻醉诱导，1％戊巴比妥钠腹腔麻醉维持下，左心室注射荧光素酶标记的pca细胞造模研究pca骨转移。造模成功后，每周进行2次活体生物发光成像(bioluminescence imaging，bli)监测小鼠骨转移情况。具体步骤如下：c57bl/6j或balb/c-nu小鼠吸入2％异氟烷诱导麻醉状态，腹腔注射1％戊巴比妥钠维持麻醉状态；无菌的pbs缓冲液重悬rm-1或pc-3细胞，配置细胞浓度为2×10 5个/ml，胰岛素针吸取100μl备用。定位并消毒小鼠心脏注射部位，垂直进针见血回冲后，将细胞全部注入左心室。2min后腹腔注射100μl荧光素钠盐溶液(15mg/ml,yeasen)；5min后将麻醉状态小鼠置于活体成像仪(caliper life sciences,usa)检测荧光素信号确认造模是否成功。实验后期小鼠出现弓背等恶病质状态后，麻醉状态下脱颈处死小鼠，解剖并收集小鼠双腿，福尔马林固定储存。使用小动物microct扫描(bruker，skyscan1276)并在ct图像上测量溶骨面积。石蜡包埋小鼠腿骨，切片保存以备ihc、h&e等实验使用。使用imagej v1.52分析计算溶骨及肿瘤病灶面积。[0068]药物处理：体内mdscs耗竭实验，腹腔注射anti-gr-1(200ug/只，2次/周，bioxcell)。体内mdscs扩增实验，皮下注射重组小鼠csf2(0.6ug/只，2次/周，peprotech)；腹腔注射anti-csf2(20ug/只，2次/周，bioxcell)。体外mdscs扩增实验，将重组小鼠csf2加入含10％fbs的培养基(浓度20ng/ml，peprotech)；将anti-csf2抗体加入含10％fbs的培养基(浓度20ng/ml，bioxcell)。相同剂量相同浓度的同型igg抗体作为对照。[0069](11)多标组织免疫荧光(if)[0070]组织免疫荧光染色采用panovue四色多标记试剂盒(人源，tsa-rm)和四色多标记试剂盒(鼠源，tsa-rab)，并按使用说明书操作。具体步骤如下：第一轮单染：60℃烤片2-3h；二甲苯脱蜡5min，重复3次；梯度乙醇水化，100％乙醇×2次，95％乙醇×1次，75％乙醇×1次，每次3min；37℃3％h 2 o 2去除内源性过氧化氢酶，摇床15min；柠檬酸盐修复液微波修复，高火5min，中火20min；自然冷却，甩干、组化笔画圈；含0.3％triton x-100的pbs孵育15-30min(破膜，可选)；tbst漂洗2次；切片放置于湿盒内，室温下封闭液封闭20min(山羊抗兔封闭液)；室温保湿状态下，一抗孵育1h，tbst漂洗2次；室温保湿状态下，二抗孵育10min，tbst漂洗2次；荧光染色放大信号，载玻片上滴加1×染料工作液100ul(使用信号放大液按1:100稀释)，室温保湿状态下孵育10min，tbst漂洗2次。追加后续染色：重复微波修复至荧光染色放大信号的所有步骤3次(每次选用不同的荧光染料，最后一次染dapi)。tbst漂洗2次后，灭菌水漂洗1次。载玻片上滴加超强抗淬灭封片剂，加盖玻片，指甲油封片，暗室内保存或在荧光显微镜下观察并判读结果。使用imagej v1.52分析计算荧光强度灰度值。[0071](12)多色流式细胞术[0072]脱颈处死小鼠，75％酒精消毒，解剖小鼠腿骨，剔除腿骨肌肉和软组织，放入p60培养皿。培养皿内加入消化液(消化液成分：1.25mg/ml胶原酶d、0.85mg/ml胶原酶v、50ug/ml dnase i、1mg/ml分散酶ii、1％双抗、10％fbs和10mm hepes)，并将腿骨剪成数个小段，研磨释放骨髓内细胞。37℃、80rpm摇床40min。细胞筛过滤，收集细胞悬液，离心(1500rpm，5min)。加入1ml红细胞裂解液，室温裂解2min，重悬离心(1500rpm，5min)，加入含2％fbs的pbs后，重悬分装至1.5ml ep管(100ul/管)。每管加入1ul抗鼠cd16/32抗体和1ul抗鼠ig2g抗体，置于冰上封闭30min。每管加入0.5ul染色抗体，避光染色30min。漂洗1次，重悬离心(1500rpm，5min)，弃掉上清。每管加入300ul含2％fbs的pbs，重悬后上机检测(cytoflex，beckman)。使用flowjo v10.6.2分析数据。相关配色方案及抗体见表2。[0073]表2多色流式细胞术配色方案[0074][0075](13)细胞分选[0076]采用cd8+ t细胞分选试剂盒(stemcell，catalog#19853)从健康小鼠脾脏中分选获得cd8+ t细胞。采用mdscs分选试剂盒(stemcell，catalog#19867)从荷瘤小鼠脾脏中分选获得mdscs细胞。具体操作步骤如下：制备单细胞悬液，加入兔封闭血清(cd8+ t分选：50ul/ml)或fcr blocker(mdscs分选：40ul/ml)，同时加入cocktail(50ul/ml)，吹打混匀，孵育10min；震荡30s，加入链霉亲和素rapidspheres(cd8+ t分选：125ul/ml；mdscs分选：75ul/ml)，吹打混匀，孵育5min；将每一管液体补齐至2.5ml，放入磁力架，静置3min；倒转磁力架，将管内液体倒入新的流式管，上机检测(cytoflex，beckman)或准备下一步实验。[0077](14)t细胞增殖抑制实验[0078]实验前准备(coating)：配置1μg/ml浓度anti-cd3抗体的pbs,12孔板内每孔加入300ul，4℃过夜。另外预留非coating孔。细胞标记cfse：准备分选好的mdscs和cd8+ t细胞并计数，用含10％fbs的pbs重悬细胞，配置5×106个细胞/ml浓度；加入2um cfse，震荡混匀，静置10min；离心(1500rpm，5min)，弃掉上清，漂洗两次，含10％fbs的新鲜培养基重悬细胞。[0079]共培养：取出coating好的孔板，重悬cd8+ t细胞并加入anti-cd28抗体至终浓度为1μg/ml。按1:0，1:1，1:5的比例(cd8+ t：mdscs)将cd8+ t细胞和mdscs加入各孔内培养；未加anti-cd3抗体和anti-cd28抗体刺激的cd8+ t细胞作为对照。放入培养箱内培养(5％co2 37℃)，视情况定期更换新鲜培养基；共培养第4-5天上机检测。使用flowjo v10.6.2分析数据。[0080](15)多因子蛋白芯片检测[0081]选用mouse cytokine array c2(raybiotech，aam-cyt-2)多因子蛋白芯片检测，并按使用说明操作。具体步骤如下：样品制备：收集低浓度血清培养基条件下，培养48h后的rm-1-bhlhe22和rm-1-vector细胞培养上清(2％fbs培养基)。孵育盒中加入2ml封闭缓冲液，完全覆盖膜表面，室温振荡孵育1h。弃封闭液，加入700ul样品，4℃振荡孵育过夜。弃去样品，漂洗。配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，每管加入2ml的1×封闭液，混匀后分别向两张膜上加入1ml孵育，室温孵育2h。漂洗后，加入2ml hrp-链霉亲和素，室温振荡孵育2小时。漂洗后，配制检测液c和d的混合液，向每张膜上加入0.5ml的混合液，孵育2min后用滤纸吸干混合液。上机检测(imagequant las4000化学发光成像分析系统)或-20℃冰箱保存。多因子蛋白检测指标见表3。[0082]表3多因子蛋白芯片检测指标[0083][0084](16)细胞转录组测序(rna-seq)[0085]收集对数生长期bhlhe22过表达组和vector组的rm-1细胞(3×3)和pc-3细胞(3×3)。rna抽提质检：采用tianmo#tr205-200试剂盒抽提rna。抽提的总rna采用agilent bioanalyzer 2100(agilent technologies,santa clara,ca,us)检测rna完整性，并使用qubit 3.0 fluorometer(life technologies,ca,usa)和nanodrop one spectrophotometer(thermo fisher scientific inc,usa)检测总rna浓度及纯度。rna文库构建：mrna的分离→mrna的片段化→第一链cdna合成→第二链cdna合成→链末端修复→3’末端加a→添加连接接头→链富集→测序样本文库构建完成。使用qubit 3.0 fluorometer检测构建文库的浓度，agilent2100检测文库大小，实验文库构建符合标准，方可进行后续上机测序。[0086]测序：依照cbot user guide标准流程，在illumina novaseq 6000测序仪配套的cbot上进行簇cluster的生成和第一向测序引物杂交。按照illumina novaseq6000 user guide所示提前准备好测序所用试剂，将携有cluster的flow cell上机。选用paired-end程序，进行双端(pe)测序。测序过程由illumina提供的data collection software控制，实时分析测序结果数据。[0087](17)组织样本收集[0088]本项研究从广州市第一人民医院及中山大学附属第一医院病理科收集了2008年5月到2020年3月期间前列腺癌患者的穿刺活检样本、手术样本、正常前列腺组织样本以及临床病理资料。组织样本经石蜡包埋后切片储存或储存于液氮罐内。本项研究共使用了132例不伴骨转移和60例伴骨转移的前列腺原位癌组织样本以及30例前列腺癌骨转移组织样本。本项研究中前列腺癌患者的临床样本和临床病理资料均经过患者同意和伦理委员会批准。随访患者总数及相关临床病理资料见表4。[0089]表4前列腺癌患者临床病理资料[0090][0091]注：psa,prostate-specific antigen,前列腺特异性抗原；bm,bone metastasis,骨转移；n-bm:non-bone metastasis,非骨转移；x2 test，卡方检验。[0092](18)统计学分析[0093]统计学分析及图表采用spss17.0和graphpad prism8进行。两组连续正态分布数据采用t检验，连续非正态分布数据采用mann whitney u检验。3组及3组以上正态分布数据采用单因素方差分析(one-way anova)。非正态分布和等级数据的相关性分析采用spearman相关分析；生存资料数据采用kaplan-meier分析和log-rank检验。检验水准＝0.05，双侧。实验数据均表示为平均值±标准差，独立重复实验三次。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。[0094]2、实验结果[0095](1)如图1a所示，bhlhe22在伴有骨转移的pca原发灶(pca/bm)中的表达量较不伴有骨转移的pca原发灶(pca/nbm)中的表达量明显增加，在pca骨转移组织(bone metastasis，bm)中的表达量进一步升高。接下来，我们分析了geo数据库gse77930的表达谱测序结果，如图1b所示，发现bhlhe22在pca骨转移组织中的表达量相对于pca原发灶和pca其他脏器转移部位明显上调。基于tcga-prad中的数据进一步分析发现，与pca/nbm相比，pca/bm中bhlhe22水平显著升高(图1c)。此外，基于tcga-prad的kaplan-meier分析显示，高bhlhe22表达预示着更短的无病生存期(图1d)。与我们的pca患者随访结果一致，高bhlhe22表达预示着不良的临床病理特征以及更短的总生存期和无骨转移生存期(表4、图1e和图1f)。以上结果提示bhlhe22在伴有骨转移的pca组织中表达上调，在pca骨转移组织中表达量进一步升高，并且与pca患者的骨转移状态及不良预后相关。[0096](2)通过左心室注射荧光素酶标记的pca细胞(rm-1和pc-3细胞系)构建骨转移小鼠模型(免疫活性c57bl/6j小鼠和免疫缺陷balb/c裸鼠)。采用活体生物发光信号(bli)监测骨转移。我们观察到，在鼠源前列腺癌rm-1细胞中过表达bhlhe22后，免疫缺陷balb/c裸鼠中肿瘤骨转移能力无明显差异(图2a-图2c)。同时，在人源前列腺癌pc-3细胞中过表达bhlhe22后,在免疫缺陷balb/c裸鼠中肿瘤骨转移能力无明显差异(图2d-图2f)。有趣的是，在同基因型免疫活性c57bl/6j小鼠中，bhlhe22过表达后显著促进rm-1细胞肿瘤骨转移(图2g)。随后，我们通过microct扫描及h&e染色进一步分析了c57bl/6j小鼠中骨转移肿瘤溶骨面积及肿瘤病灶范围。microct扫描和h&e染色分析表明，在免疫活性c57bl/6j小鼠中，rm-1细胞过表达bhlhe22组具有更大面积的溶骨性病变和肿瘤病灶(图2h-图2k)。免疫活性c57bl/6j小鼠的生存分析结果显示，过表达bhlhe22预示着更短的总生存期和无骨转移生存期(图2l和图2m)。ucsc基因组数据库物种同源性分析(phylop算法)显示进化过程中bhlhe22在小鼠和人中具有良好的保守性(图3a)。bhlhe22的高保守性(cdna水平上89％的序列一致,蛋白质水平上94％的序列一致)提示bhlhe22在人和小鼠中发挥了相似的调控功能。此外，我们还在体外实验中评估了bhlhe22的生物学功能。transwell迁移/侵袭实验表明，rm-1和pc-3细胞的过表达bhlhe22组与载体组迁移和侵袭能力无明显差异(图3b和图3c)。综上，我们发现bhlhe22在免疫活性和免疫缺陷小鼠之间表现出了不同的促肿瘤骨转移能力。同时，在评估肿瘤细胞转移能力的体内和体外实验之间也观察到了不同的表现。[0097]基于bhlhe22的表达，我们对tcga-prad数据集进行了基因集富集分析(gsea)。有趣的是，gsea分析显示，高bhlhe22表达组的免疫应答负调控和ifn-γ产生负调控途径被激活(图3d)。此外，分析我们的bhlhe22过表达和对照组pca细胞rna测序(rna-seq)结果，gsea结果提示bhlhe22过表达的pca细胞激活了免疫应答负调控和t细胞介导的免疫负调控途径(图3e)。同时，gene ontology结果提示(go分析)，免疫应答相关基因集位于top10富集(图3f)。以上结果提示bhlhe22可能以免疫相关方式促进pca骨转移。[0098](3)采用多标组织免疫荧光检测的方法(if)，选用人源mdscs细胞marker(cd33)、cd8+ t细胞marker(cd8)、bhlhe22和dapi，分别对pca/bm和bm组织进行检测(图4a和图4b)。我们的结果提示，无论是pca/bm或bm组织，高bhlhe22表达组的mdscs浸润数量明显高于低bhlhe22表达组。低bhlhe22表达组的cd8+ t细胞浸润数量明显高于高bhlhe22表达组(图4d和图4e)。随后，我们进一步通过if检测了经左心室注射rm-1-bhlhe22和rm-1-vector细胞后的c57bl/6j小鼠骨转移骨髓中浸润的mdscs(gr-1+)、cd4+ t和cd8+ t细胞数量。我们的结果显示，与rm-1-vector组相比，rm-1-bhlhe22组显著增加了骨髓中mdscs细胞的浸润数量，降低了骨髓中cd4+ t和cd8+ t细胞的浸润数量(图4c和图4f)。[0099]通过采集左心室注射rm-1-vector和rm-1-bhlhe22细胞后的c57bl/6j小鼠骨转移骨髓细胞标本，利用多色流式细胞仪进行免疫细胞群体分析。首先，rm-1-bhlhe22和rm-1-vector骨髓中cd45+7aad-细胞和cd3+cd11b-细胞比例相当(图4g和图4h)。随后，我们测定了cd45+7aad-细胞中单核mdscs(m-mdscs)和多形核mdscs(pmn-mdscs)、cd4+ t细胞、cd8+ t细胞、treg、巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞-1(tam-1)、肿瘤相关巨噬细胞-2(tam-2)和nk细胞的浸润比例。我们发现，与rm-1-vector组相比，rm-1-bhlhe22组明显升高了mdscs的浸润比例(尤其是m-mdscs)，但是显著降低了cd4+ t和cd8+ t细胞的浸润比例(图4i-图4l)。此外，我们还研究了与mdscs功能相关的因子arg-1以及与cd8+ t细胞功能相关的因子ifn-γ和pd-1。结果显示，rm-1-bhlhe22骨转移样本中arg-1+ mdscs比例升高(图4i和图4j)，ifn-γ+cd8+ t细胞比例降低，pd-1+cd8+ t细胞比例升高(图4k和图4m)。此外，为了证实这些cd11b+gr-1+细胞确实是功能性mdscs，我们进行了mdscs与t细胞体外共培养增殖抑制实验。将分选获得的cd11b+gr-1+细胞与cd8+ t细胞按不同比例共培养。结果显示，cd11b+gr-1+细胞强烈抑制了cd3和cd28抗体诱导下的t细胞的增殖和活化(图4n和图4o)。随后，对骨转移造模后的c57bl/6j小鼠注射anti-gr-1抗体，耗竭小鼠体内的mdscs细胞。结果发现，用anti-gr-1抗体耗竭mdscs后，rm-1-bhlhe22组mdscs明显减少，t细胞显著增多(图5a和图5b)。我们还分析了rm-1-vector和rm-1-bhlhe22组骨转移骨髓细胞标本中的其他免疫细胞群体，结果显示treg、巨噬细胞、tam-1、tam-2和nk细胞的浸润比例无明显差异(图5c-图5f)。综上所述，我们认为高bhlhe22表达的pca细胞诱导了mdscs浸润，并通过mdscs耗竭t细胞驱动形成pca骨转移免疫抑制性tme。[0100](5)将过表达bhlhe22的鼠源rm-1与人源pc-3前列腺癌稳定株细胞与相应的vector组细胞分别送rna-seq测序分析。结果显示，相较于vector组rm-1-bhlhe22与pc-3-bhlhe22中共同表达上调了103个基因，共同表达下调了37个基因(fc＞1.5)。在这些差异基因中，我们着重寻找了介导细胞之间直接的相互作用的基因和分泌性功能因子的基因。令人惊讶的是，集落刺激因子-2(csf2)是唯一在rm-1-bhlhe22与pc-3-bhlhe22中共同表达上调的分泌性细胞因子(图6a)。随后，我们采用多因子蛋白芯片检测收集的rm-1-bhlhe22和rm-1-vector细胞培养上清，结果表明rm-1-bhlhe22细胞培养上清中的csf2显著增多。这提示了我们，在过表达bhlhe22后，rm-1细胞分泌了更多的csf2(图6b)。同时，western blot结果表明，过表达bhlhe22的pc-3和rm-1细胞系和bhlhe22组c57bl/6j小鼠bm肿瘤组织中的csf2表达增加(图6c和图6d)。以上结果显示，过表达bhlhe22后，pca细胞的csf2表达及分泌增加。[0101]采集左心室注射后的c57bl/6j小鼠骨髓切片标本，通过多标组织免疫荧光(if)和免疫组化(ihc)染色检测bhlhe22，csf2，肿瘤细胞增殖marker(ki-67)，以及mdscs(gr-1、s100a9)、cd4+ t、cd8+ t细胞浸润之间的关系。我们的结果提示，与vector组相比，bhlhe22组肿瘤浸润mdscs数量更多，cd4+ t和cd8+ t细胞浸润的数量更少，csf2的表达量更高(图6e-图6g)。ki-67标记的阳性染色提示bhlhe22组小鼠骨转移肿瘤的增殖速度更快(图6f和图6h)。基于ihc染色结果，csf2+ pca细胞与mdscs(gr-1+)细胞的相关性分析表明，csf2与mdscs浸润数量呈正相关(r＝0.645,p《0.001；图6i)。有趣的是，在tcga-prad数据库中bhlhe22与csf2同样呈正相关(r＝0.230,p《0.001；图6j)。上述结果提示，csf2是bhlhe22+ pca诱导mdscs扩增，驱动免疫抑制性骨tme形成的潜在功能因子。[0102]在体内mdscs浸润分析的实验中，将c57bl/6j小鼠分别左心室注射rm-1-vector和rm-1-bhlhe22细胞，以非荷瘤c57bl/6j小鼠作为vehicle组。然后，用重组小鼠csf2(同型igg作为对照)处理非荷瘤小鼠，用anti-csf2抗体(同型igg作为对照)处理左心室注射小鼠。注射30天后，bli结果显示anti-csf2抗体处理后的骨转移小鼠中，vector组与对照组(igg处理组)的小鼠骨转移bli信号未见明显差异，而bhlhe22组在anti-csf2抗体处理后的骨转移bli信号及骨转移肿瘤病灶大小较对照组(igg处理组)减小(图7a-图7d)。收集以上各组小鼠骨髓进行流式细胞术分析，与重组小鼠csf2处理后的非荷瘤小鼠相似，bhlhe22过表达强烈促进了mdscs浸润。而anti-csf2抗体处理后显著抑制了mdscs浸润(图7e)。在体外mdscs扩增分析的实验中，我们将分选后的小鼠mdscs(cd11b+gr-1+)细胞用csfe染色标记，再将标记的小鼠mdscs与rm-1-vector或rm-1-bhlhe22细胞共培养。非共培养的cd11b+gr-1+细胞作为vehicle组。然后，我们分别用重组小鼠csf2(同型igg作为对照)处理非共培养细胞，anti-csf2抗体(同型igg作为对照)处理共培养细胞。4天后流式检测cfse染色，与重组小鼠csf2处理组相似，rm-1-bhlhe22细胞与mdscs的共培养强烈促进了mdscs的体外增殖，而anti-csf2显著抑制了mdscs的体外增殖(图7f)。上述结果证实，csf2是bhlhe22驱动的骨转移免疫抑制性tme的关键调控因子。[0103]实施例2[0104]1、材料和方法[0105](1)质粒[0106]将鼠源prmt5(nm_013768.3)的cdna通过pcr扩增并克隆到plvx-hyg质粒载体(plvx-prmt5-hyg)中，plvx-hyg质粒载体用作对照。将两个靶向prmt5(nm_013768.3)序列的短发夹rna(shrna)克隆到plko.1质粒载体，靶向序列：shrna prmt5#1,5′?ggtgaacacagtgcttcatgg-3′；shrna prmt5#2，5′?ccatgaagcactgtgttcacc-3′。[0107](2)dna pull-down[0108]根据jaspar数据库预测的bhlhe22结合csf2启动子区域的位点序列，共设计了4个大小约50-150bp的5′标记的生物素dna探针(p1,p2,p3和p4，focobio)，未偶联探针的链霉亲和素磁珠作为阴性对照组。所有dna探针序列见表5。dna pull-down采用磁珠法试剂盒(focobio)进行实验，按使用说明书步骤操作。主要步骤如下：吸取100ul链霉亲和素磁珠加入无酶的1.5ml ep管内，洗涤液(0.1m naoh，50mm nacl)清洗磁珠两次，磁力架吸附磁珠，弃洗涤液；裂解细胞，获取蛋白裂解液；将生物素标记的dna探针与磁珠偶联，50ul磁珠结合100pmol dna探针，室温下孵育15-30min；将100pmol偶联后的dna探针与200ul蛋白质-dna结合预混液(20ul蛋白质-dna结合缓冲液，60ul 50％甘油，60ul蛋白裂解液，60ul无酶水)充分混匀，室温下孵育1h；将ep管放入磁力架中，洗涤dna结合蛋白复合物，弃上清，重复两次；加入100ul洗脱缓冲液，室温下孵育15-30min；将ep管放入磁力架中，保留上清。98℃加热洗脱的样品10min。凝胶电泳或-80℃储存。[0109]表5 csf2启动子区域dna探针序列[0110][0111](3)荧光素酶报告基因实验[0112]pcr扩增csf2启动子、csf2启动子p1段(包括野生型和突变型)后，分别将该片段插入到pgl4.10-basic(addgene，plasmid#46387)萤光素酶报告质粒，pgl4.10-basic作为阴性对照。筛选阳性克隆，扩增后提纯备用。实验前一天消化对数生长期细胞并接种细胞，5％co2 37℃培养箱内培养。等细胞融合度达到70-80％，准备质粒转染细胞(转染步骤同第一部分材料和方法)。转染36h后，裂解细胞，提取蛋白。使用dual luciferase reporter assay kit试剂盒(promega)，按使用说明书步骤操作，检测并计算荧光素酶信号。标准化为萤火虫荧光素酶活性/renilla荧光素酶活性，并与空载对照组比较。csf2启动子p1段dna序列见表6。[0113]表6 p1段野生型和突变型序列[0114][0115][0116](4)染色质免疫沉淀(chip)[0117]chip实验用于检测蛋白质和dna的结合，通过后续的pcr实验验证结合的dna片段。采用ez chip chromatin immunoprecipitation kit试剂盒(millipore,bedford,ma)进行chip实验，按使用说明书步骤操作。主要步骤如下：向细胞培养皿中加入1％甲醛溶液，维持dna-蛋白质复合物的相互作用；加入1ml含5ul蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，充分裂解后收获细胞悬浮液；超声破碎处理，剪切dna为染色质小片段；使用目标蛋白抗体结合dna-蛋白质复合物(同型igg作为对照)，4℃翻转过夜；加入60ul的protein a来沉淀复合物，4℃孵育1h；洗脱复合物，解交联并回收dna片段；设计特异性pcr引物扩增csf2启动子。chip-qpcr引物序列见表7。[0118]表7 chip-qpcr引物序列[0119][0120][0121][0122](5)免疫共沉淀(co-ip)[0123]预冷pbs清洗细胞后，向细胞培养皿内加入1ml含1％cocktail(广谱蛋白酶抑制剂)和0.5％pmsf的lysis buffer(50mm tris-hcl ph 7.4+150mm nacl+1mmedta+1％triton x-100)裂解细胞，4℃摇床30min；置于冰上操作，刮取收集蛋白至1.5ml ep管；4℃12000×g离心10min；收集上清；-20℃冰箱取出anti-flag和anti-ha beads(sigma)；或制作igg胶珠(将protein g珠子和igg抗体偶联，空白胶珠作为对照)；将清洗好的beads或制备好的igg胶珠加入蛋白样本，4℃翻转过夜；第二天在4℃12000×g条件下离心30s，弃上清；每管加入500ulripa处理5min，4℃12000×g离心30s，弃上清，重复3次；向沉淀的beads或igg胶珠中加入蛋白裂解液；4℃12000×g离心30s，收集上清，测定蛋白浓度；-80℃冰箱保存或进行下一步实验。[0124](6)银染[0125]银染实验采用pierce silver stain kit(thermo scientific，24612)进行，按使用说明书步骤操作。主要步骤如下：60-70rpm室温摇床固定过夜(20ml无水乙醇+4ml乙酸+16ml灭菌水)；100ml 30％乙醇洗涤10min；200ml双蒸水洗涤10min；室温下30ml 1×增敏液增敏10min；200ml双蒸水洗涤10min，重复一次；30ml 1×银染液染色10min；100ml双蒸水洗涤1min；加显色液显色3-7min；观察到合适的显色强度后及时中止显色。小刀片割下差异条带送蛋白质谱检测。[0126](7)蛋白质谱检测(mass spectrometry，ms)[0127]酶解条带后收集上清液，剩下的胶块中加100ul萃取液(67％乙腈，含2％甲酸)，室温保温30min，超声15min后离心，合并上清液，离心浓缩干燥以备质谱分析。离心干燥后的样品重新溶解于nano-lc流动相a(0.1％甲酸/水)中装瓶上样，进行在线lcms分析。将6ul溶解后的样品加入nanoviper c18预柱上(3μm，100)，20ul体积冲洗脱盐。液相为easy nlc 1200纳升液相系统(thermofisher,)，脱盐保留(预柱)后分离(分析柱)，实验所用梯度为流动相b(80％乙腈，0.1％甲酸)下30min内由5％升高至38％。质谱采用thermofisher q exactive系统(thermofisher)结合纳升喷雾nano flex离子源(thermofisher)，1.9kv喷雾电压，275℃离子传输管加热温度。质谱扫描方式为信息依赖采集工作模式下(dda)，一级质谱扫描分辨率70000，扫描范围350-2000m/z，最大注入时间100ms。最多采集20个电荷为2+到5+的二级图谱/dda循环，二级质谱离子最大注入时间50ms。[0128](8)细胞免疫荧光(if)[0129]24孔板内加入细胞爬片后接种细胞，5％co2 37℃培养箱内培养；当细胞融合度达50％后，取出24孔板；预热的pbs漂洗3遍；4％多聚甲醛固定30min；固定后pbs漂洗1遍；0.3％triton x-100的pbs破膜15min；pbs漂洗1遍；封闭液封闭30min；封闭液稀释一抗(当有两种待检测基因时，需选用不同物种来源的抗体)，每孔加入稀释后的一抗200ul，4℃摇床过夜；第二天取出孔板，pbs漂洗3遍；封闭液稀释荧光二抗(选用与一抗同种属来源的抗体)，每孔加入稀释后的荧光二抗200ul，室温下避光孵育1h；pbs漂洗3遍；每孔加入200uldapi染核(避光，20min)；挑出细胞爬片，加5ul防淬灭封片剂，封片拍照。[0130](9)mdscs共培养实验[0131]6孔板内提前接种rm-1-bhlhe22和rm-1-vector细胞；用cfse染色标记分选后的mdscs细胞(mdscs分选和cfse染色步骤同第一部分材料和方法)，每孔内加入1×106个标记后的mdscs与rm-1细胞共培养。将6孔板放入5％co2 37℃培养箱内培养。4天后，收集mdscs后，用cd45、cd11b、gr-1染色，流式细胞仪检测。[0132](10)动物实验及药物处理[0133]小鼠造模及评价骨转移状态方法同第一部分材料和方法内容。药物处理：体外共培养实验中，将prmt5抑制剂gsk591加入细胞培养基内(5um，targetmol)。动物体内实验中，予小鼠灌胃prmt5抑制剂gsk3326595(50mg/kg/day，targetmol)，或腹腔注射anti-csf2(20ug/只，2次/周，bioxcell)，或腹腔注射anti-pd-1(200ug/只，2次/周，bioxcell)。相同剂量相同浓度的同型igg抗体作为对照。[0134]2、实验结果[0135](1)荧光素酶报告基因试验结果显示，相较于vector组，在rm-1和pc-3过表达bhlhe22的稳定株细胞中激活了csf2启动子的荧光素酶活性(图8a)。同时，为研究bhlhe22是否与csf2启动子结合，我们设计了染色质免疫沉淀实验(chip)，发现csf2启动子dna与抗bhlhe22抗体能够共沉淀，并通过qpcr进行了验证(图8b和图8c)。此外，基于jaspar和cis-bp数据库，我们比较了bhlhe22在人和小鼠中的dna-binding motif，发现人和小鼠具有相同的dna-binding motif(图8d)。[0136]将蛋白裂解液与anti-flag胶珠共孵育后，得到了各实验组的蛋白洗脱液。跑胶银染后发现在60-75kda和35-45kda之间有数条明显的差异表达条带。将洗脱液和差异条带送蛋白质谱分析(ms)鉴定，结果共鉴定出了10个潜在的转录共因子(图8e)。同时，为了进一步确定csf2启动子上bhlhe22具体的结合位点(bhlhe22 binding sites，bbss)和关键的转录共因子。我们在jaspar数据库中分析发现bhlhe22在csf2的启动子区域有6个高可信度的bbss(图8f)。随后，我们共设计了4个涵盖这些bbss序列80～180bp大小的5′标记的dna生物素探针(表5)。分别将这4个dna探针与磁珠偶联后作为实验组(p1,p2,p3和p4)，将未偶联探针的磁珠作为阴性对照组(control)，将添加了等量的四个偶联后的探针的一组作为阳性对照组(p1-4)。dna pull-down试验获取洗脱液并跑胶银染发现，在60～75kd之间，p1和p1-4泳道再次出现了与co-ip试验相同的差异条带，而在p2、p3和p4泳道中没有出现相同的差异条带(图8g)。因此，我们认为bhlhe22与csf2启动子p1段结合，binding motif序列为预测位点中csf2转录起始位点(tss)上游-47～-38bp(caaatatgcc)。进一步通过western blotting分析检测dna探针洗脱液，结果显示60～75kd之间的差异条带为蛋白精氨酸甲基转移酶-5(protein arginine methyltransferase 5,prmt5)(图8h)。此外，我们用rm-1-bhlhe22细胞进行细胞免疫荧光染色(if)，结果显示bhlhe22和prmt5主要分布于核内并且呈共定位表现(图8i)。为了再次验证bhlhe22是否与csf2启动子区域p1段结合并转录激活csf2，我们构建了3个csf2启动子荧光素酶载体质粒：pgl4-fl-bbs(全长)、pgl4-p1-bbs-wt(p1段)或pgl4-p1-bbs-mut(p1段突变)。然后将这3种载体质粒转染进rm-1-bhlhe22细胞和hek293t细胞(转染hek293t时，同时转染bhlhe22过表达载体质粒)。荧光素酶报告基因试验结果显示，p1段的bhlhe22结合位点序列(caaatatgcc)突变后显著降低了csf2启动子荧光素酶活性(表6和图8j)。为了再次验证bhlhe22与prmt5蛋白之间的相互作用，在内源性和外源性免疫共沉淀试验(co-ip)中，我们检测发现bhlhe22蛋白可以将prmt5蛋白沉淀下来，同时prmt5蛋白也可以将bhlhe22蛋白沉淀下来(图8k和图8l)。以上结果表明，bhlhe22与prmt5形成转录复合物，并且与csf2启动子区域p1段caaatatgcc序列结合，转录激活csf2的表达。[0137]检测了过表达bhlhe22后rm-1和pc-3细胞系中prmt5的表达水平。结果显示过表达bhlhe22后prmt5的表达水平无明显变化(图8m)。因此，我们认为bhlhe22和prmt5不存在相互调控的关系。接下来，我们在3个细胞系rm-1-vector(bhlhe22-/prmt5+)、rm-1-bhlhe22(bhlhe22+/prmt5+)和rm-1-bhlhe22-prmt5-sh(bhlhe22+/prmt5-)中设计了bhlhe22和prmt5针对csf2启动子序列的chip实验并通过qpcr验证。我们发现，在rm-1-vector细胞中，bhlhe22和prmt5均无法与csf2启动子共沉淀。然而，在rm-1-bhlhe22和rm-1-bhlhe22-prmt5-sh细胞中，bhlhe22均能够与csf2启动子共沉淀。但prmt5仅在rm-1-bhlhe22细胞中检测到与csf2启动子共沉淀，而在rm-1-bhlhe22-prmt5-sh细胞中则未检测到共沉淀(图8n)。如bhlhe22/prmt5复合物作用的模式图所示(图8n)，当bhlhe22缺失时，prmt5不能与csf2启动子结合。prmt5结合csf2启动子的能力依赖于bhlhe22。以上结果揭示了bhlhe22/prmt5复合物结合csf2启动子的具体模式：bhlhe22结合csf2启动子并招募prmt5形成转录复合物，prmt5不能与csf2启动子直接结合。[0138](2)敲减prmt5后，通过qpcr和western blot检测了rm-1-bhlhe22细胞系中的csf2表达水平。结果显示，敲减prmt5可以显著降低csf2的表达水平(图9a和图9b)。如前所述，prmt5具有甲基化组蛋白表观调控基因表达的功能。我们接下来检测了不同组蛋白位点(h4r3、h3r2和h3r8)的甲基化水平。值得注意的是，敲减prmt5的rm-1-bhlhe22细胞系中，western blot检测到h4r3me2a和h3r2me2s水平降低(图9c)。已有研究表明，h4r3(h4r3me2a)和h3r2(h3r2me2s)的二甲基化可以激活肿瘤细胞中的基因转录。因此，为了检测prmt5是否催化csf2启动子区域的h4r3残基和h3r2残基甲基化，我们在rm-1-bhlhe22细胞中进行了chip-qpcr试验。结果显示，h4r3me2a和h3r2me2s在csf2启动子上富集，敲减prmt5可以降低h4r3me2a和h3r2me2s的富集(图9d)。此外，通过qpcr和western blot检测，我们发现prmt5抑制剂gsk591抑制prmt5的活性后，明显降低了rm-1-bhlhe22细胞中csf2的表达水平(图9e和图9f)。一致地，chip-qpcr试验中，我们观察到gsk591显著降低了rm-1-bhlhe22细胞csf2启动子上h4r3me2a和h3r2me2s的富集(图9g)。[0139]在体内mdscs浸润分析中，分别用rm-1-vector或rm-1-bhlhe22或rm-1-bhlhe22-prmt5-sh细胞系对c57bl/6j小鼠左心室注射造模。其中，共有两个rm-1-bhlhe22组，选择一组接受gsk3326595处理(同型igg处理作为对照)。30天后，bli结果显示敲减prmt5和gsk3326595处理后的小鼠骨转移bli信号及骨转移肿瘤病灶大小较rm-1-bhlhe22对照组减小(图9h和图9i)。收集以上各组小鼠骨髓进行流式细胞术分析，结果发现敲减prmt5和prmt5抑制剂gsk3326595处理后显著降低了bhlhe22过表达骨转移肿瘤组织中mdscs的浸润(图9j)。在体外mdscs扩增分析中，首先将分选后的小鼠mdscs(cd11b+gr-1+)细胞用csfe标记，再将标记的小鼠mdscs细胞与rm-1-vector或rm-1-bhlhe22或rm-1-bhlhe22-prmt5-sh细胞共培养。此外，在两个与rm-1-bhlhe22细胞共培养组中，选择一组接受gsk591处理(同型igg作为对照)。4天后，流式检测cfse染色显示bhlhe22过表达强烈促进mdscs扩张，敲减prmt5和prmt5抑制剂gsk591显著抑制mdscs扩张(图9k)。综上，prmt5催化csf2启动子h4r3me2a和h3r2me2s位点甲基化，表观激活csf2的表达，最终促进肿瘤mdscs浸润。[0140](3)左心室注射rm-1-bhlhe22细胞造模成功后第3天，我们开始用抗csf2和/或抗pd-1抗体(同型igg作为对照)治疗小鼠(图10a)。利用bli监测骨转移，micro ct扫描及h&e染色测量bm病灶(图10b和图10c)。实验终点设定至第70天。单独抗csf2或抗pd-1治疗在bm发生率上与对照组无显著差异。然而，抗csf2联合ict治疗方案显著降低了bm发生率，在所有治疗组中最为有效的抑制了骨转移发生(图10d)。进一步分析发现，虽然在bm发生率上没有明显差异，但是不同于igg组的骨转移肿瘤快速进展情况，单独抗csf2和单独抗pd-1治疗可以减缓肿瘤进展，缩小bm病灶面积(图10e-图10g)。令人关注的是，在所有治疗组中联合治疗组是减缓肿瘤进展，减少bm病灶面积最有效的一组(图10e-图10g)。生存分析显示，联合治疗组明显延长了小鼠的总体生存期和无骨转移生存期(图10h和图10i)。ki-67增殖标记物的阳性染色结果显示，联合治疗对小鼠骨转移rm-1-bhlhe22前列腺肿瘤生长有明显的抑制作用(图10c和图10j)。[0141]多色流式细胞术检测了治疗后的bhlhe22+骨转移肿瘤组织中的mdscs和t细胞浸润情况。与对照组相比，单独抗csf2治疗可以减少mdscs的浸润，增加cd4+ t和cd8+ t细胞的浸润，但不能促进ifn-γ+cd8+ t细胞的扩张(图11a-图11c)。单独抗pd-1治疗促进了ifn-γ+cd8+ t细胞的扩张，但对骨转移瘤内mdscs、cd4+ t和cd8+ t细胞的浸润无明显影响(图11a-图11c)。值得注意的是，抗csf2联合ict治疗显著降低了mdscs的浸润，增加了cd4+ t和cd8+ t细胞的浸润，同时又促进了ifn-γ+cd8+ t细胞的扩张(图11a-图11c)。综上，我们的研究结果表明，抗csf2联合ict治疗通过解除mdscs驱动的免疫抑制tme，有效提高了ict对bhlhe22+ pca骨转移的治疗疗效。[0142](4)左心室注射rm-1-bhlhe22细胞造模成功后第3天，我们开始用gsk3326595和/或抗pd-1抗体(同型igg作为对照)治疗小鼠(图12a)。利用bli监测骨转移，micro ct扫描及h&e染色测量bm病灶(图12b和图12c)。实验终点设定至第70天。单独gsk3326595治疗与对照组的bm发生率无明显差异。但gsk3326595与ict联合治疗有效抑制了骨转移的发生(图12d)。与对照组相比，单独gsk3326595治疗能够减慢肿瘤进展，缩小bm病变面积(图12e-图12g)。重要的是，在所有实验组中联合治疗组最有效地减缓了肿瘤进展，减少了bm病灶面积(图12e-图12g)。生存分析显示，联合治疗组显著延长了小鼠的总体生存期和无骨转移生存期(图12h和图12i)。ki-67增殖标记物的阳性染色结果显示，联合治疗对小鼠骨转移rm-1-bhlhe22前列腺肿瘤生长有显著抑制作用(图12c和图12j)。多色流式细胞术结果表明，gsk3326595治疗降低了骨转移肿瘤病灶中mdscs浸润，增加了cd4+ t和cd8+ t细胞浸润，但无法促进ifn-γ+cd8+ t细胞的扩张(图13a-图13c)。然而，与ict联合治疗时，gsk3326595降低了mdscs、增加了cd4+ t、cd8+ t细胞的浸润，同时又促进了ifn-γ+cd8+ t细胞的扩张(图13a-图13c)。以上结果表明，gsk3326595与ict联合治疗解除了mdscs驱动的免疫抑制tme，有效提高了ict对bhlhe22+ pca骨转移的治疗疗效。[0143](5)采用ihc在人pca骨转移组织样本(bm)中检测了bhlhe22,prmt5,csf2的表达水平、肿瘤增殖标志物ki-67以及免疫浸润细胞数量。bhlhe22染色结果显示：26.7％的bm样本呈阴性，20％的bm样本呈弱阳性，23.3％的bm样本呈中度阳性，30％的bm样本呈强阳性(图14a)。已有研究表明prmt5作为致癌基因，在pca细胞中广泛表达，促进pca细胞生长的。一致地，我们的结果显示prmt5在bm样本中呈阳性染色，并且bhlhe22-low组与bhlhe22-high组之间无明显差异(图14b)。进一步分析发现，与bhlhe22-low组相比，bhlhe22-high组中肿瘤浸润mdscs的数量更多，cd4+ t和cd8+ t细胞的数量更少，csf2的表达量更高(图14c-图14e)。肿瘤增殖标记物ki-67染色提示bhlhe22诱导的骨浸润mdscs有利于pca骨转移肿瘤的生长(图14c和图14f)。此外，相关性分析显示，bhlhe22与cd4+ t细胞浸润(r＝-0.585,p《0.001；图14g)、cd8+ t细胞浸润(r＝-0.593,p《0.001；图14h)呈负相关。相反，bhlhe22与mdscs浸润(r＝0.688,p《0.001；图14i)、csf2表达(r＝0.678,p《0.001；图14j)呈正相关。[0144]综上所述，我们的研究结果揭示了pca骨转移中bhlhe22/prmt5/csf2通路驱动形成免疫抑制性骨tme及相关的分子机制(图14k)。bhlhe22作为潜在的生物标志物有助于筛选出适合接受ict治疗的pca患者。在bhlhe22+ pca患者中prmt5抑制剂gsk3326595联合ict以及抗csf2联合ict是抑制pca骨转移的有效治疗方案。[0145]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。